核酸提取類型
核酸提取是分子生物學研究中的關鍵步驟，根據(jù)不同的核酸類型和應用需求，主要包括4種類型。
·總RNA提取：總RNA包括大量的rRNA和少量的mRNA、tRNA、snRNA等。總RNA的提取通常采用三相酚-氯仿抽提法，通過酚相和氯仿相的分離，有效地將核酸分離出來，適用于從細胞裂解液中提取RNA。
·miRNA提取：miRNA是短小且高度保守的RNA分子，其提取需要使用特殊的方法，如基于柱層析的技術或磁珠法。這些方法能夠高效地富集和分離miRNA，以便于后續(xù)的定量分析和功能研究。
·基因組DNA提取：基因組DNA提取通常采用堿裂解法或酚-氯仿法，這些方法能有效地分離和純化高分子量的DNA。保證DNA的完整性對于后續(xù)的基因組研究和診斷至關重要。
·質粒提取：質粒提取旨在從細菌或真核細胞中分離質粒DNA，常用的方法包括堿裂解法和硅膠柱層析。這些方法能夠有效地去除雜質，得到高純度的質粒DNA用于分子克隆和轉染實驗。

質粒最早是20世紀50年代初期在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的，是細菌、酵母菌、放線菌等生物中獨立于染色體(或擬核)以外的閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，具有自主復制能力，可在子代細胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達所攜帶的遺傳信息。目前，質粒已成為基因工程中一種常用、簡單的載體，除了在科研領域的普遍應用，質粒也被廣泛用于多類生物醫(yī)藥產品的研發(fā)生產環(huán)節(jié)，如重組蛋白藥物、疫苗、基因治療藥物以及CAR-T藥物等。

細菌質粒是一類環(huán)狀雙鏈DNA，大小從1Kb至200 Kb以上不等，一般存在于細胞質中，獨立于細胞染色體之外自主復制的遺傳成分。實驗室常用堿裂解法提取質粒DNA，菌體在氫氧化鈉和SDS溶液中裂解，蛋白質與DNA發(fā)生變性，當加入中和液后，質粒DNA分子能夠迅速復性，呈溶解狀態(tài)，離心時留在上清液中，蛋白質與細菌基因組DNA纏繞呈絮狀，離心時可沉淀下來，上清中的質粒用吸附法純化。

質粒的粗提取物通常包含3種構型的質粒DNA：
·共價閉合環(huán)狀DNA (cccDNA)：這是質粒DNA最常見的構型。質粒的兩條鏈沒有斷裂，形成一個完整的閉環(huán)結構。具有高度的穩(wěn)定性和完整性，是基因工程中常用的質粒構型。
·超螺旋開環(huán)DNA (ocDNA)：質粒的一條鏈斷裂，形成一個超級螺旋的開環(huán)結構。ocDNA的穩(wěn)定性稍遜于cccDNA，但仍可用于某些實驗。
·松弛的環(huán)狀分子線形DNA (lDNA)：質粒的兩條鏈均斷裂，形成一個松弛的環(huán)形結構。IDNA的穩(wěn)定性較差，通常在質粒提取過程中產生較少。
電泳時，由快到慢依次是：超螺旋＞線性DNA＞開環(huán)DNA。

2. 質粒提取原理
質粒提取即去除RNA，將質粒與細菌基因組 DNA分開，去除蛋白質及其它雜質，以得到相對純凈的質粒。質粒提取主要包括三個步驟：菌體擴繁、菌體裂解釋放質粒DNA和質粒DNA的分離與純化。質粒提取從具體操作方法分為：堿裂解法、煮沸裂解法、小量一步提取法、試劑盒法、酶解法及其它提取方法等。從提取產量上分為：小提、中提、大提。

1)堿裂解法
原理：根據(jù)共價閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓撲學結構差異來分離的。在強堿環(huán)境下，細菌的細胞壁和細胞膜被破壞，基因組DNA和質粒DNA被釋放出來，線性DNA雙螺旋結構被破壞而發(fā)生變性。雖然在強堿的條件下共價閉合環(huán)狀質粒DNA也會發(fā)生變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結合在一起。當加入pH4.8的乙醋酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復中性時，共價閉合環(huán)狀質粒DNA復性快，而線性的染色體DNA復性緩慢，細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用鉀離子取代鈉離子時，復合物會從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復性的質粒DNA。
優(yōu)點：操作簡單，成本低，適用于大部分常規(guī)實驗。
缺點：提取純度可能不夠高，需要進一步純化。

2)煮沸法
原理：將細菌懸浮于含Triton X-100和能消化細胞壁的溶菌酶緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細胞壁外，還有助于解開DNA鏈的堿基配對，并使蛋白質和染色體DNA變性。但是，閉環(huán)質粒DNA彼此不會分離，這是因為他們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓撲結構，當溫度下降后，閉環(huán)DNA的堿基又各自就位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體核蛋白質，就可從上清中回收質粒DNA。煮沸裂解法對于小于15kb的小質粒很有效，可用于提取步至lmL(小量制備)，多至250mL(大量制備)菌液的質粒，并且對大多數(shù)的大腸桿菌菌株都適用。
優(yōu)點：操作簡單，時間短。
缺點：條件過于劇烈，易造成質粒斷裂，回收率較低。

3)小量一步提取法
原理：由于細菌染色體DNA比質粒大得多,受機械力后細菌染色體DNA會被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細胞碎片上，并發(fā)生變性。同樣受機械力質粒DNA會變性，機械力消失后復性。但質粒DNA的復性快，仍溶于溶液而細菌染色體DNA復性較慢，會形成不溶的網狀結構，通過高速離心可以分離得到質粒DNA 。

4)試劑盒法
原理：通常采用改良的SDS-堿裂解法，結合硅膠膜在高鹽及低pH值(pH<7.5)時可結合DNA，在低鹽及高pH值(pH≥8)條件下洗脫的原理達到快速純化質粒DNA的目的。

質粒提取方法中，最常用的是堿裂解法，它具有得率高，適用面廣，快速，純度高等特色，堿裂解法是根據(jù)共價閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓撲學結構差異來分離的。其原理是：在強堿環(huán)境(pH=12.0-12.6)下，細菌的細胞壁和細胞膜被SDS破壞，基因組DNA和質粒DNA被釋放出來，宿主細胞的蛋白質、染色體及線性DNA雙螺旋結構被破壞而發(fā)生變性(質粒DNA因為其分子量小而纏結嚴密不易變性)。雖然在強堿的條件下共價閉合環(huán)狀質粒DNA也會發(fā)生變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結合在一起。當加入pH=4.8的乙醋酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復中性時，共價閉合環(huán)狀質粒DNA復性快(可恢復天然構象)，而線性的染色體DNA復性緩慢，細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用鉀離子取代鈉離子時，復合物會從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復性的質粒DNA(在高鹽條件下，細胞碎片、變性的蛋白質和染色體DNA發(fā)生沉積，離心后可去除。上清中的質粒DNA可經過乙醇沉積或許硅膠膜特異性吸附等方法，將質粒DNA從上清中回收)。

5)酶解法
原理：利用特異性酶裂解細胞壁或細胞膜，釋放質粒DNA。
步驟：(1) 細胞收集：培養(yǎng)含有質粒的細菌，離心收集細胞。(2) 酶處理：加入溶菌酶等酶類，裂解細胞壁。(3) 裂解細胞：加入裂解緩沖液，釋放質粒DNA。(4) 純化：使用柱子或其他純化方法分離質粒DNA。
優(yōu)點：提取純度高，適用于高需求實驗。
缺點：成本較高，操作時間較長。

6)其他方法
離子交換法：利用質粒DNA與離子交換介質的結合來分離和純化。
超離心法：利用質粒DNA與其他分子的密度差異，通過超離心分離。

總結來說，堿裂解法主要使用三種溶液(根據(jù)1979年J.Doly發(fā)表文章A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA)。The principle of alkaline extraction就是選擇性地讓chromosomal DNA發(fā)生變性，而plasmid DNA不會發(fā)生變性，仍然以雙鏈形式存在。

堿裂解法提取質粒DNA具有產量高、操作快速等優(yōu)點，其原理是：在堿性溶液中，雙鏈DNA的氫鍵斷裂，DNA雙螺旋結構遭到破壞而發(fā)生變性，但是由于質粒DNA的分子量相對較小，而且呈環(huán)狀超螺旋結構，即使在堿裂解的高pH條件下，兩條互補鏈也不會完全分離；當加入中和緩沖液時，變性質粒DNA又可恢復到原來的構型，而變性的大分子量細菌染色體DNA則不能復性，并與細胞碎片、蛋白質、SDS等形成不溶性復合物；并通過離心，細胞碎片、染色體DNA及大部分蛋白質等都可被除去，而質粒DNA及小分子量的RNA留在上清液中；混雜的RNA可用RNA酶(RNase A)消除，殘留的蛋白質可以用酚和氯仿處理去除。

·溶液I (P1)--溶菌液(包含葡萄糖以及EDTA)
主要成分：25mM Tris-HCl(pH8.0)、10mM EDTA、50mM葡萄糖(Glucose)，P1也可以不含葡萄糖。
主要作用：P1的主要作用是將菌體沉淀懸浮。
葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA因機械剪切力作用而降解。
EDTA：(1)螯合Mg^2＋、Ca^2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用(DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基)；(2)EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環(huán)境。

P1的兩個試劑從用途上看，用水或者LB也可以代替，少了EDTA，提取速度加快一點，也不會降解那么快。加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部，少了也沒有關系，只要重懸充分也是一樣的效果。

注意事項：溶液P1需要在使用前加入RNA酶(RNaseA)以降解溶液中的RNA，并保存在4°C以防止蛋白質失活。

·溶液II(P2)--NaOH-SDS液
主要成分：250mM NaOH、1%(w/v) SDS(十二烷基磺酸鈉)。
主要作用：P2的主要作用是對細胞進行裂解。
NaOH：核酸在pH>5和pH<9的溶液中是穩(wěn)定的，但當pH>12或者pH<3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2 mo1/L，加抽提液時，該系統(tǒng)的pH就高達12.6，因而促使染色體DNA變性。
SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：(1)溶解細胞膜上的脂質與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。(2)解聚細胞中的核蛋白。(3)SDS能與蛋白質結合成為R-O-SO^3-…R⁺-蛋白質的復合物，使蛋白質發(fā)性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中(用RNase去除RNA時)受到干擾。

溶液II最重要是NaOH，一定要用要新從濃NaOH稀釋制備0.4 N NaOH，保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。NaOH是最佳的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細胞膜發(fā)生了從bilayer(雙層膜)結構向micelle(微囊)結構的相發(fā)化所導致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌。

注意事項：添加溶液P2時需要控制時間和避免劇烈震動，操作要溫柔，以防止基因組DNA斷裂并污染樣品。

·溶液III(P3)--3mol/L NaAc(pH=4.8)溶液
主要成分：3M醋酸鉀(potassium acetate)、5M醋酸。
主要作用：P3的主要作用是中和第二步加入的強堿以及清除蛋白質等細胞內的雜質。
醋酸：作用是中和強堿。長時間暴露在強堿性溶液(如氫氧化鈉)中會對DNA結構造成破壞，因此需要中和處理。
醋酸鉀：作用是清除蛋白質等雜質。在加入P3后，會觀察到大量沉淀的形成。這些沉淀是由于醋酸鉀中的鉀離子與混合物中的SDS多肽發(fā)生相互作用所致，進而生成不溶于水的十二烷基硫酸鉀(PDS)。PDS的沉淀不僅會沉淀變性的蛋白質，還會與纏繞在變性蛋白質上的基因組DNA一同沉淀，導致大部分基因組DNA也被共沉淀。此外，高離子濃度的溶液會加速這一沉淀過程。在中和溶液后，變性蛋白質表面的電荷減少，也會促進變性蛋白質的沉淀。

·Wash buffer(PE)
主要成分：10mM Tris-HCl(pH7.5)、80%乙醇(Ethanol)。
主要作用：去除多余的鹽離子。實驗中大家普遍使用硅膠柱進行DNA提取。在DNA吸附到硅膠柱后，需要使用PE洗滌液清洗掉多余的鹽離子。PE中含有高濃度的乙醇，由于乙醇可能影響后續(xù)的酶切或測序反應，因此在洗去DNA之前，在離心機中需要對柱子進行“空甩”，以除去乙醇。

·Elution buffer (EB、TE)
主要成分：10mM Tris-HCl (pH=7.5)或者ddH₂O。
主要作用：洗脫硅膠柱上的DNA樣品。
EB緩沖液：EB中不應含有過高濃度的鹽離子，因為高鹽環(huán)境中，鹽陽離子會破壞硅膠負氧根和水之間的氫鍵，導致整體硅膠帶正電荷，進而吸引攜帶負電荷的DNA分子。此外，加熱過的洗脫液(<50℃)能促進DNA從硅膠膜上迅速釋放。在離心之前，延長EB緩沖液在膜上停留時間能更有利于DNA的洗脫。使用ddH₂O進行洗脫效率較低，建議在第一次洗脫后，將洗脫液重新加入硅膠柱進行第二次洗脫。

質粒抽提按得到質粒DNA的量可分為小提、中提、大提：

·小提質粒
特點：簡便、快速，適用于高通量提取。
濃度：100-200 ng/μL。
用途：適用于測序、PCR、腺病毒包裝以及多數(shù)細胞轉染實驗。
適用場景：適用于1-5 mL菌液，提取簡便、快速，可用于DNA序列分析、酶促反應、PCR等實驗，要求質粒濃度不高。

·中提質粒
特點：質粒DNA量較高。
濃度：0.7-1 μg/μL。
用途：適用于測序和多數(shù)細胞轉染實驗。
適用場景：適用于30-50 mL菌液，可用于酶切、PCR、測序、連接、轉化等實驗。

·大提質粒
特點：質粒DNA量非常高、雜質少、無內毒素。
濃度：0.5-2 μg/μL。
用途：適用于慢病毒、腺相關病毒包裝，以及多數(shù)細胞轉染或其他需要大量質粒的實驗。
適用場景：適用于100-500 mL菌液，適用于大規(guī)模提取，提取的質粒純度高，無內毒素，可用于對質粒純度有要求的實驗。

3. 實驗材料
·儀器設備及實驗用具
高壓滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫搖床、臺式離心機、漩渦振蕩器；
培養(yǎng)用試管、量筒、冰盒、微量離心機、微量移液器、吸管頭若干。
常見的質粒提取試劑盒包括OMEGA、BIOMIGA、Sigma、TaKaRa、Promega、天根、康為世紀、生工等品牌，它們大多都是在堿裂解法基礎上進行優(yōu)化改進而成。

·試劑配制
LB培養(yǎng)基: 稱取胰蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl 3g，用雙蒸水溶解至300mL，用10mol/L NaOH溶解調pH值至7.0-7.2，固體培養(yǎng)基需要加入瓊脂(1.5%)，高壓滅菌。
氨芐青霉素(Amp，100mg/mL): 氨芐青霉素100 mg，加入1 mL雙蒸水溶解。
100×TE緩沖液(含1 mol/L Tris-HCI和100 nmol/L EDTA): 稱取Tris 121.1 g，EDTA-Na2 37.22 g，先用800 mL雙蒸水加熱攪拌溶解，用鹽酸調pH值至8.0(大約需要鹽酸20 mL)，再加雙蒸水定容至1000 mL。
溶液Ⅰ: 50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl (pH=8.0)，10mM EDTA (pH=8.0)。1M Tris-HCl(pH=8.0) 12.5mL，0.5M EDTA(pH=8.0) 10mL，葡萄糖4.730g，加ddH2O 至500mL。高壓滅菌15min，貯存于4℃。
溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1mL，加ddH2O 至10mL。使用前臨時配置。
溶液Ⅲ：醋酸鉀(KAc)緩沖液，pH 4.8。5M KAc 300mL，冰醋酸57.5ml，加ddH2O 至500ml。4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
苯酚/氯仿/異戊醇(25：24：1)
乙醇(無水乙醇、70%乙醇)
5×TBE：Tris堿54g， 硼酸 27.5g，EDTA-Na₂·2H₂O 4.65g，加 ddH₂O 至1000mL。高壓濕熱滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/span>
溴化乙錠(EB)：10 mg/mL
RNase A：不含 DNA 酶(DNase-free) RNase A 的 10mg/mL，TE 配制，沸水加熱15min，分裝后貯存于-20℃。
6×loading buffer(上樣緩沖液)：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青 FF，40%(w/v)蔗糖水溶液。
1% 瓊脂糖凝膠：稱取1g 瓊脂糖于三角燒瓶中，加100mL 0.5×TBE，微波爐加熱至完全溶化，冷卻至60℃左右，加 EB 母液(10mg/mL)至終濃度0.5μg/mL (注意：EB為強誘變劑，操作時帶手套)，輕輕搖勻。緩緩倒入架有梳子的電泳膠板中，勿使有氣泡，靜置冷卻30min 以上，輕輕拔出梳子，放入電泳槽中(電泳緩沖液 0.5×TBE)，即可上樣。

4. 質粒提取實驗步驟(以堿裂解法為例)
質粒提取主要包括四個步驟：菌體擴繁、菌體裂解釋放質粒DNA、質粒DNA的分離與純化和質粒DNA的電泳檢測，今天以堿裂解法為例進行介紹。

實驗步驟：
(1)搖菌培養(yǎng)
1) 將鑒定測序正確的克隆菌液涂在LB固體平板。
2) 置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12-17h，待長出菌落。
3) 滅菌15ml離心管內加入5ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，編號標記。
4) 挑取單克隆菌落放置液體培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)基放置1個菌落。
5) 37℃，180 rpm，振蕩培養(yǎng)過夜(約 12-16h)。

(2)收獲細菌并裂解
主要有堿裂解法、煮沸法、酚氯仿裂解法，根據(jù)不同的實驗目的和儀器設備擇取不同的實驗方案。
·堿裂解法：
1) 柱平衡。向吸附柱中加入500 μL的Buffer B溶液。12000 rpm離心1 min，棄掉廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
2) 取3 mL過夜培養(yǎng)的菌液，12000 rpm離心1 min，棄盡上清。每次1 mL分3次完成。
3) 加入250 μL Buffer P1懸浮菌體沉淀。
4) 加250 μL Buffer P2，溫和并充分上下翻轉6-8次，使菌體充分裂解直至形成清亮粘稠的溶液。
5) 加入350 μL Buffer P3，溫和并充分上下翻轉6-8次，充分混勻出現(xiàn)白色絮狀沉淀，12000 rpm 離心10 min。
6) 吸取上一個步驟中的上清轉移至吸附柱，12000 rpm離心1 min，棄廢液。
7) 吸附柱放回離心管加入600 μL Buffer W，12000 rpm離心1 min，棄廢液。
8) 重復上述步驟。
9) 將吸附柱放回離心管，12000 rpm離心2 min，將吸附柱中殘存漂洗液去除。
10) 將吸附柱移入1.5 mL離心管，在吸附柱中央加入50 μL去離子水/Elution buffer。室溫放置2 min，12000 rpm離心2 min，收集質粒溶液。
11) 收集到的溶液即為質粒溶液。測量溶液濃度和純度，剩下的質粒溶液置于-20℃冰箱保存。

·煮沸法：
1) 將1.5ml培養(yǎng)液倒入EP管中，4℃下12000 rpm離心30 s。
2) 棄上清，將管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體流盡。
3) 將菌體沉淀懸浮于120 mL STET溶液中，渦旋混勻。
4) 加入10 mL新配制的溶菌酶溶液(10 mg/mL)，渦旋振蕩3秒鐘。
5) 將EP管放入沸水浴中，50s后立即取出。
6) 用微量離心機4℃下12000 rpm離心10 min。
7) 用無菌牙簽從EP管中去除細菌碎片。
8) 取20 mL進行電泳檢查。

·酚氯仿裂解法：
1) 從瓊脂平板上挑取轉化菌陽性克隆，接種到標準LB培養(yǎng)液中(含有卡那霉素30 μg/mL)搖菌12 h;收集1.5 mL菌液，8000 g/min離心3 min，棄上清，沉淀加入200 μL TE，充分混勻；加入400 μL酚氯仿(1：1體積)混合液，劇烈振動10 s，混勻；12 000g/min離心5 min，1 mL胰島素注射針收集上清，盡量避免吸入蛋白沉淀層；上清經國產0.22 μm針式濾器過濾1次；向過濾上清液內加入2倍體積無水乙醇，振蕩10 s，12000 rpm離心5 min；沉淀溶于20 μL的RTE溶液中，37℃水浴。
2) 按PstI內切酶說明書進行酶切反應(37°C，1h)。酶切產物10 μL，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。
3) PCR引物根據(jù)參考文獻設計，預計擴增產物片斷大小為714 bp。
4) 常規(guī)制備感受態(tài)菌E.coli DH5α，提取質粒DNA常規(guī)轉化感受態(tài)，涂于含有卡那霉素(30 μg/mL) LB培養(yǎng)平板中，37°C培養(yǎng)15 h后觀察篩選克隆情況。

(3)質粒的純化
1) 將之前提取好的質粒放入1.5 mL離心管中，加入1/10體積的3 mol/L 無菌乙酸鈉溶液。
2) 加入2倍體積的無水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6 h或過夜。
3) 4℃，高速離心機14000 rpm，離心20 min。
4) 棄去上清，70%乙醇洗2次。
5) 空氣干燥，可置超凈工作臺干燥。
6) 加200 μL無菌水溶液干燥后所得沉淀，即為質粒溶液。
7) 紫外分光光度計測量質粒濃度和產量。

測量OD260和OD280的值：質粒DNA濃度=OD260×50×稀釋倍數(shù)(μg/mL)。

質粒DNA可以用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度和純度。一般來說，OD230為碳水化合物、多肽、苯酚等，OD260為核酸，OD280為蛋白質。OD260/OD280的比值常用于判DNA或RNA溶液的純度，其通常在1.8~2.0左右，純DNA的比值為1.8，純RNA為2.0。OD260/OD230比值大于2.0，如果比值小于2.0，說明被糖類、鹽類或有機溶劑污染。

(4)質粒DNA 的電泳檢測
觀察瓊脂凝膠中DNA 的最簡單方法是利用熒光染料溴化乙錠進行染色，該物質含有一個可以嵌入DNA的堆積堿基之間的一個平面基團，這個基團的固定位置及其與堿基的密切接近，導致染料與DNA結合并呈現(xiàn)熒光，其熒光產率比游離染料溶液有所增加。

DNA 吸收254nm 處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結合的染料本身則在302nm 和366nm 有光吸收。這兩種情況下，被吸收的能量可在可見光譜紅橙區(qū)的590nm 處重新發(fā)射出來。因此，當凝膠中含有游離溴化乙錠時即可以檢測到少量的DNA。

取制備的質粒DNA 1-2 μL，加適當loading buffer 混勻上樣，采用1-5 V/cm 的電壓，使DNA 分子從負極向正極移動至合適位置，取出凝膠置紫外燈下檢測并拍照。

5. 注意事項
(1) 高壓滅菌消毒的過程必須專人看管，以免發(fā)生安全事故。
(2) 抗生素不能高壓滅菌，需通過過濾除菌。培養(yǎng)基滅菌后，待冷卻至不燙手時才加入抗生素，若是已滅菌并冷藏備用的液體培養(yǎng)基，則在使用前根據(jù)需要加入抗生素。
(3) 為避免細菌污染環(huán)境，多余的菌液需經煮沸殺菌后方可丟棄。
(4) 細菌的細胞壁成分會抑制限制性內切酶的活性，離心收集細菌時若未除盡培養(yǎng)基，其中殘留的細菌細胞壁可能會對酶切產生影響。
(5) 加入溶液I、溶液II、溶液III后，混勻時一定要溫和，以防染色體DNA分子斷裂。
(6) 酚/氯仿抽提時，離心分層后吸取上層水溶液應非常小心，避免吸入下層的酚/氯仿和中間層的沉淀。
(7) 離心時應將離心管的管蓋突出小柄統(tǒng)一朝向外側，以保證沉淀于離心管的外側，便于后續(xù)操作。
(8) 使用之前，需要把試劑盒中的一小管RNA酶加入到Buffer P1，4℃保存。
(9) Buffer EB在65-70℃水浴預熱，可以增加提取效率。

6. 常見問題及解答
(1) 質粒提取試劑盒選擇
質粒提取方法主要根據(jù)質粒DNA分子量的大小，所用細菌的種屬，細菌裂解釋放DNA后的純化方法和實驗要求來選擇。
·質粒DNA的分子大于15kb時，在質粒抽提過程中容易受損，可以采用比較溫和的裂解方法，將細菌懸浮于等滲的葡萄糖溶液中，加入溶菌酶和EDTA破壞細胞壁和細胞膜，這樣可以緩解高滲透壓的細菌在釋放質粒DNA時的壓力，保護質粒DNA。
·小分子的質粒DNA可以選用相對劇烈的方法來分離DNA�？梢杂弥蠓蟹�，堿裂解法或者加入溶菌酶，EDTA和去垢劑裂解細菌。這些方法會使DNA變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結合在一起，在恢復正常條件后，DNA便會復性。

·對于那些經變性劑、溶菌酶及加熱處理后能釋放大量碳水化合物的大腸桿菌菌株，則不推薦使用煮沸法。而這些碳水化合物在密度梯度中會緊靠超螺旋的DNA分子形成致密模糊的區(qū)帶，因此很難避免，而這些碳水化合物可抑制多種限制酶的活性。這類菌株制備質粒時，不宜采用煮沸法。
·菌株含有限制性核酸內切酶A的不宜使用煮沸法。因為煮沸不能使內切酶A完全失活，在后續(xù)實驗中再用限制性內切酶消化時，質粒DNA會被降解。此時必須用酚：氯仿進行抽提。

(2) 質粒提取的得率低或無質粒
菌體老化：重新涂布篩選，挑選新的菌落進行液體培養(yǎng)。
質粒拷貝數(shù)低：篩選新的高拷貝的菌體。
堿裂解不充分：收集的菌體含量較高時，可以酌情提高溶液1/2/3的含量。
乙醇殘留，漂洗液沒有去除干凈。
洗脫處理不當：洗脫液加入較多或者洗脫時間過短。

(3) 質粒的純化不足
混有RNA，RNase A處理不徹底。
混有基因組DNA，避免加入溶液2，3時劇烈震蕩。如果加入溶液P2后過于粘稠，無法溫和混勻，請減少菌體用量；細菌培養(yǎng)時間過長也會導致細胞和DNA的降解。

(4) 質粒DNA產量低
可能原因：細菌培養(yǎng)不充分；裂解不完全；質粒DNA丟失在提取過程中。
解決方案：確保細菌培養(yǎng)充分，通常需要過夜培養(yǎng)，達到適宜的OD600值；檢查裂解緩沖液的成分和pH值，確保裂解充分；檢查各步驟操作是否規(guī)范，避免質粒DNA的流失；使用更高效的提取試劑盒。

(5) 質粒DNA純度低
可能原因：基因組DNA或RNA污染；蛋白質或其他雜質殘留。
解決方案：在裂解過程中加入RNA酶，去除RNA污染；嚴格控制堿裂解時間，避免基因組DNA斷裂混入質粒DNA；充分離心，去除細胞碎片和蛋白質；使用酚-氯仿提取或硅膠柱純化質粒DNA。

(6) 質粒DNA降解
可能原因：操作過程中存在DNase污染；存儲條件不當。
解決方案：使用無DNase的試劑和耗材；操作時戴手套，避免手部接觸樣品；將質粒DNA存儲在-20℃或-80℃冰箱中，避免反復凍融。

(7) 質粒DNA無法轉化或低轉化效率
可能原因：質粒DNA質量不高；受體細胞狀態(tài)不佳。
解決方案：確保質粒DNA的純度和濃度，進行測序驗證；使用新鮮的感受態(tài)細胞，確保細胞處于最佳狀態(tài)；優(yōu)化電轉化或熱轉化條件。

(8) 質粒DNA濃度測定不準確
可能原因：樣品中含有蛋白質、鹽類或其他雜質；光譜儀校準不準確。
解決方案：進行純化步驟，去除雜質；使用分光光度計前進行校準，并使用適當?shù)目瞻讓φ铡?/span>

(9) 質粒DNA無法完全溶解
可能原因：質粒DNA沉淀不完全溶解；溶液pH值不合適。
解決方案：使用溫和的溶液如TE緩沖液溶解質粒DNA；輕輕混勻，避免劇烈搖動；確保溶液的pH值適合質粒DNA溶解。

(10) 出現(xiàn)剪切或片段化的質粒DNA
可能原因：操作過程中物理剪切；過度震蕩或攪拌。
解決方案：輕柔操作，避免劇烈的震蕩或攪拌；使用合適的提取方法，減少質粒DNA的機械損傷。

(11) 質粒純度的選擇
同樣對于一般的載體構建等常規(guī)實驗和送去測序檢測的話，用手工和試劑盒制備的DNA都能達到要求。如果是質粒需要用來做細胞轉染實驗的話，則需要無熱源，無內毒素(LPS)。

(12) 菌液較多
可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中。收集的菌體量以能夠充分裂解為佳，菌體過多裂解不充分會降低質粒的提取效率。未徹底混勻的菌塊會影響裂解，導致提取量和純度偏低，菌體懸浮后若有較多的氣泡也會影響裂解，導致導致提取量和純度偏低。質粒提取使用的溶液I主要是懸浮菌體，溶液II裂解菌體，其中的高濃度NaOH破會細菌細胞壁和細胞膜，使菌體中的質粒DNA釋放出來，溶液III主要是中和溶液，使溶液恢復中性環(huán)境，利于質粒DNA復性，溶液II中SDS的Na⁺會被K⁺置換，SDS變?yōu)镻DS并結合大分子的基因組DNA，蛋白質和細胞碎片形成不溶物，然后通過離心可以得到含有質粒DNA的上清。因此加入溶液II后要溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免使基因組DNA斷裂污染質粒。所用時間不應超過5min，以免質粒受到破壞。如果菌液沒有變清亮，可能是由于菌體過多，裂解不徹底，若繼續(xù)進行后續(xù)操作會得到鼻涕狀的沉淀，無法通過離心分離得到含有DNA 的上清液，因此在加入溶液Ⅱ后菌液沒有變清亮后可以適當按比例加大溶液Ⅱ和后續(xù)溶液Ⅲ的用量。

(13) 菌液培養(yǎng)時間
使用TB培養(yǎng)基培養(yǎng)菌液的時間一般在16 h左右，菌液OD值在2.5-2.6左右為佳，培養(yǎng)時間短會導致菌體生長不充分，培養(yǎng)時間過長菌體會出現(xiàn)死亡，導致活菌比例降低，進而基因組DNA污染概率增大，培養(yǎng)時間應優(yōu)選的控制在12-16 h內。

(14) 宿主菌株
宿主菌株的種類將會影響質粒的收獲量。含內源核酸酶的宿主菌株如HB101、JM101、JM110、TG1以及它們的衍生菌株，通常因為內源核酸酶的存在，或者在提取過程中釋放出來的核酸酶的作用下，將會顯著影響最終收獲量，或者純化到的質粒容易降解，推薦將質粒轉化至不含內源核酸酶的宿主菌株中，如Top10、DH5α進行質粒純化。

(15) 質�？截悢�(shù)低
由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數(shù)載體，或者加大提取的菌液量，并減小洗脫時的體積。當所提取的質粒大于10 kb時，由于菌體承載力有限，大質粒復制效率往往會低于普通質粒，因此推薦增大菌液量以獲得更好的提取產量。

(16) 菌體中無質粒
有些質粒本身不能在某些菌種中穩(wěn)定存在，經多次轉接后有可能造成質粒丟失。例如，柯斯質粒在大腸桿菌中長期保存不穩(wěn)定，因此不要頻繁轉接，每次接種時應接種單菌落。有時菌種保存一段時間后會出現(xiàn)質粒丟失的情況，導致無法提出質粒，若有保存的質粒可以轉化后再挑取單克隆搖菌提質粒。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

(17) 堿裂解不充分
使用過多菌體培養(yǎng)液，會導致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加裂解液的用量。并確保細菌混懸均勻。菌體沉淀未能充分懸浮或懸浮后有較多氣泡也會導致裂解不充分，要注意讓菌體充分懸浮并將較多的氣泡用移液器吸出。對低拷貝數(shù)質粒，提取時可加大菌體用量并加倍使用試劑盒溶液，可以有助于增加質粒提取量和提高質粒質量。

(18) 溶液使用不當
溶液II在溫度較低時可能出現(xiàn)渾濁，可置于42℃水浴保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，方可使用。

(19) 吸附柱過載
不同產品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質粒量很大，請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少;若質粒是非常高的拷貝數(shù)或宿主菌具有很高的生長率，則需減少LB培養(yǎng)液體積。

(20) 質粒未全部溶解(尤其質粒較大時)
洗脫溶解質粒時，可適當加溫或延長溶解時間。

(21) 乙醇殘留
漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。漂洗液中乙醇的殘留會影響后續(xù)的酶反應(酶切、PCR等)實驗。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，可置于室溫靜置20-30min，或放到超凈臺上風吹15 min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

(22) 鹽離子污染
當漂洗操作不當或漂洗不充分時將導致鹽離子污染，該指標可通過OD260/230比值鑒定，通常大于2.0是可接受的。在使用試劑盒時應確保Wash Buffer的漂洗次數(shù)和漂洗液加入量。

(23) 洗脫液加入位置不正確
洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫效率，若第一次沒有將洗脫液準確加到硅膠膜的中心部位，可以離心后將離心下來的洗脫液按正確方式重新上柱再次洗脫。

(24) 洗脫液不合適
DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或ddH₂O。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH=7.0-8.5間。當用水洗脫時確保其pH值在此范圍內，如果pH過低可能導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。為追求高濃度質粒而減小洗脫液體積將會導致洗脫不充分進而降低產量，因此要確保洗脫液的用量，此外Elution Buffer預熱至60℃和重復洗脫將更有利于洗脫效率提升。

(25) 洗脫體積太小
洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

(26) 洗脫時間過短
洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時在說明書的建議時間基礎上適當延長靜置或者洗脫兩次可達到較好的效果。

(27) 質粒保存方法
提取后的質粒除了本身質量外，也應注意提供適宜的保存環(huán)境，以防止質粒降解影響下游應用，一般質�？杀４嬗赥E溶液中，在4℃短期保存，在-80℃或-20℃中長期保存。除了直接保存質粒，還應將含質粒的宿主菌保存于甘油中，-80℃或液氮中可長期保存。

(28) 質粒內毒要求
內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上的一種脂多糖和蛋白復合物，當細菌裂解時會大量釋放出來。

內毒性也稱為脂多糖或LPS，是革蘭氏陰性(如大腸桿菌E.coli)胞膜上一種成分。細菌外膜的外部脂質成分完全由內毒素分子組成。一個E.coli包含約2百萬個LPS分子，每個LPS分子又由疏水性的脂質A、復雜的多糖鏈以及帶負電荷的磷酸基團組成。因此每個內毒素既包含疏水區(qū)域也包含了親水和帶電區(qū)域，從而賦予其與其它分子相互作用的獨特性質。細菌在其活躍生長時表面的內毒素成分較少，而一旦其死亡則會釋放大量內毒素。在質粒提取的裂解過程中，內毒素會從細菌的外膜釋放到裂解液中。LPS污染通常用內毒素單位(Endotoxin Units, EU)表示，通常情況下，1ng LPS對應于1-10個EU。

由于內毒素兩親性和負電荷性，性質和DNA類似，因此在質粒純化過程中會伴隨質粒一同被純化出來。

內毒素單位為EU，質粒中內毒素含量的高低常用EU/µg表示。按照EU/µg大小，質粒被分為3個級別：測序級別(>50EU/µg)、轉染級別(<50EU/µg)、無內毒素級別(<0.1EU/µg)。

(29) 影響質粒提取的因素有哪些？
質粒提取的得率和質量與很多因素有關，如宿主菌的種類和培養(yǎng)條件、細菌細胞的裂解、質�？截悢�(shù)、質粒的穩(wěn)定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟練程度等等。

(30) 為什么從革蘭氏陽性菌中提取質粒要在懸浮液中加入溶菌酶？
革蘭氏陽性菌有一層細胞壁，必須加入溶菌酶才能使之溶解。

(31) 如何根據(jù)實驗需要選擇不同級別的產品？
從純度上：各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測序、文庫篩選、連接和轉化，普通純度的質�？梢詽M足要求；而對于轉染實驗，則要求使用高純度質粒提取試劑盒方能滿足要求。
從提取的量上：1-20μg，應選擇小量提取試劑盒；20-40μg，應選擇中量提取試劑盒；大于40μg，應選擇大量提取試劑盒。
從宿主菌上：分為普通細菌質粒提取試劑盒、革蘭氏陽性菌質粒提取試劑盒和酵母菌質粒提取試劑盒，根據(jù)情況進行選擇。