化學發(fā)光免疫分析（CLIA）以高靈敏度聞名，可在低濃度下檢測分析物，在寬動態(tài)范圍內提供良好檢測限。免疫磁珠（Immunomagnetic Bead，IMB，簡稱磁珠）具有操作簡便、分離效率高、較大的比表面積及良好的物理穩(wěn)定性的優(yōu)點，是一種性能優(yōu)良的磁性分離載體，是純化、檢測和定量分析復雜分析物的通用工具。磁珠作為固相載體與CLIA相結合，在外加磁場的作用下，能夠快速與底物液相分離，磁珠以其高效分離和富集作用在免疫分析反應中使抗原對磁珠上固定化抗體的影響顯著降低。
  磁珠作為整個免疫反應和信號收集的載體具有顯著優(yōu)越性：
1）磁珠比表面積大，能結合更多的蛋白分子，可提高檢測范圍。
2）磁珠表面化學基團與蛋白形成共價偶聯(lián)，相對于物理吸附更牢固，更穩(wěn)定。
3）磁珠均勻懸浮于反應溶液中，大大增加與樣本中待測物接觸面積，減少反應所需的樣本量，同時更快達到反應動態(tài)平衡，加快反應速度，節(jié)省反應時間。
4）將連有多種捕獲蛋白的磁珠與多標記技術聯(lián)合應用，實現(xiàn)同一樣本中多個待測物同時檢測，實現(xiàn)全自動個體化檢測。

1. 常見磁珠種類及結構
1.1 種類
1）Carboxyl羧基磁珠
是一種化學發(fā)光試劑用高性能磁珠，羧基官能團用于蛋白或核酸偶聯(lián)，在酶免測定、免疫沉降、蛋白質印記解析時能夠發(fā)揮突出性能。
2）Tosyl甲苯磺�；�磁珠
因涂層中含有甲苯磺�；�所以無需羧合劑，含有氨基的抗體等分子以化學結合的方式固定在磁珠表面。隨著化學結合的進行，甲苯磺�；鶗�逐漸脫離，粒子表面親水性增強，從而維持磁珠表面偶聯(lián)物生物活性，并可有效抑制分析時的非特異性反應。
3）Streptavidin鏈霉親和素磁珠
磁珠偶聯(lián)鏈霉親和素能從樣品中對生物素標記的分子進行高純度的特異性吸收。因磁珠表面親水性聚合物涂層不會影響酶促反應進行，在PCR反應體系中混入磁珠也不會對核酸擴增產生影響。在酶免測定中，還可作為生物素標記抗體的載體進行使用。
1.2 結構
磁珠結構一般由磁性內核、包裹在外的高分子涂層及功能基層構成。在外部磁場作用下，磁珠在磁場中做定向運動，輔以微控制和檢測手段，可實現(xiàn)磁珠定位和介質分離。

                                                              磁珠結構

1） 內核：主要由純金屬（如鈷、鎳和鐵）或其氧化物等磁性材料組成，此外還可采用CoPt3、FeCo和FePt等磁性材料。
2） 高分子涂層：材料一般為聚苯乙烯、聚氯乙烯，主要用于穩(wěn)定新形成的磁珠表面和防止磁珠聚集。高分子涂層可以與多種活性物質結合，如抗原、抗體、核酸等。
3） 功能基層
蛋白質或抗體偶聯(lián)磁珠表面的穩(wěn)定性主要取決于表面性質。當磁珠表面無修飾時，抗體通過疏水相互作用被動吸附到磁珠表面。這種方式不能控制附著分子的最終方向，也無法保證捕獲分子的特異性和穩(wěn)定性。為確保偶聯(lián)穩(wěn)定性與捕獲特異性，可選擇化學修飾表面與生物修飾表面。
化學修飾表面：
①　經(jīng)典化學修飾表面：抗原或抗體直接被動吸附于化學修飾磁珠表面�；钚曰鶊F利用磁珠的表面積為抗原或抗體提供大量位點，使其與磁珠共價連接。添加到表面的經(jīng)典基團有羧基、氨基、羥基和硫酸鹽。
Table 1. 磁珠經(jīng)典化學修飾及活化方式
 

磁珠化學修飾	活化方式
羧基修飾	添加碳二亞胺（EDC）、N-羥基丁二酰亞胺（NHS）或磺基NHS和乙基（二甲氨基丙基）進行活化
氨基修飾	激活蛋白質表面羧基
羥基修飾	在非水溶液中活化，以避免中間體水解

②　預活化修飾表面：分子連接到表面預活化修飾磁珠之前無需進行初步激活，在適宜緩沖液、pH和溫度條件下即可形成穩(wěn)定共價偶聯(lián)。
Table 2. 磁珠預活化修飾及結合基團
 

磁珠預活化修飾	結合基團
甲苯磺酰基（Tosyl）修飾	中性pH值：結合蛋白質巰基；偏堿性pH值：結合氨基。
環(huán)氧基團修飾	pH值稍偏堿性：結合硫醇基團；較高pH值：結合氨基；強堿性pH值：結合含羥基的配體。
氯甲基修飾	室溫中性pH值：結合氨基

生物修飾表面（表面生物功能化）：
生物功能化磁珠由于其超順磁性被廣泛用于捕獲特定分子或細胞。生物修飾與化學修飾不同，生物修飾以非共價方式連接分子。在生物技術領域生物功能化磁珠通常用于蛋白質/分子純化等分離過程，在體外診斷試劑中作為固相載體。
①　蛋白A或G以非常高的親和力結合某些免疫球蛋白亞型。蛋白A結合大多數(shù)Ig的Fc區(qū)，蛋白G結合Ig的Fc或Fab區(qū)，可用于固定抗體；
②　鏈霉親和素具有極高親和力，鏈霉親和素與生物素之間的結合可承受高溫、大范圍pH值等極端條件。
Table 3. 磁珠功能基層對比

功能基層	作用方式	優(yōu)點	缺點
無	磁珠與抗體被動偶聯(lián)	便宜	易出現(xiàn)大量非特異性結合，產生高背景值
化學修飾	磁珠通過表面-COOH、-NH2、-OH、-SH等化學修飾基團與抗體共價偶聯(lián)	表面修飾簡單，偶聯(lián)穩(wěn)定	易出現(xiàn)聚合和非特異性結合
生物修飾	磁珠通過表面鏈霉親和素、抗IgG、蛋白A或G等生物修飾與抗體非共價偶聯(lián)	生物磁分離，無需額外洗滌；可承受高溫等極端條件	價格昂貴

2. 免疫磁珠作用原理
磁珠一般具有超順磁性，在磁場作用下實現(xiàn)結合、未結合蛋白快速分離，簡化操作，縮短反應時間。磁珠表面通過外部修飾的功能基團結合活性蛋白，作為抗原抗體反應的載體。磁珠作用方式分為直接作用和間接作用兩種，直接作用是用抗體/抗原包被磁珠直接與特異性抗原/抗體物質結合后，形成磁珠-免疫復合物。間接作用是用二抗包被磁珠，抗原與一抗進行孵育，再加入二抗偶聯(lián)的磁珠，形成磁珠-二抗-一抗-抗原復合物。復合物具有強磁響應性，在磁力的作用下定向移動，使復合物與液體中其他物質分離，達到分離、濃縮、純化特異性蛋白的目的。

                                                         磁珠作用原理

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