嵌合自身抗體受體T細(xì)胞精確靶向自身抗原特異性B細(xì)胞-重癥肌無(wú)力肌肉特異性酪氨酸激酶

 

 

背景部分介紹：

肌肉特異性酪氨酸激酶重癥肌無(wú)力(MuSK MG)是一種由MuSK自身抗體引起的慢性自身免疫性疾病，可導(dǎo)致潛在危及生命的肌肉無(wú)力。MuSK是一種跨膜受體，與神經(jīng)元蛋白聚糖agrin復(fù)合物中的脂蛋白受體相關(guān)蛋白4 (LRP4)相互作用，導(dǎo)致MuSK磷酸化并形成高密度乙酰膽堿受體(AChR)簇，這是神經(jīng)肌肉連接突觸傳遞所必需的。
 

MuSK MG疾病的嚴(yán)重程度與抗MuSK抗體滴度相關(guān)，特別是針對(duì)MuSK Ig1結(jié)構(gòu)域的IgG4自身抗體，它會(huì)破壞MuSK- LRP4的相互作用。使用利妥昔單抗消耗B細(xì)胞導(dǎo)致抗MuSK IgG相對(duì)于總IgG11減少，表明MuSK自身抗體主要由短壽命漿細(xì)胞產(chǎn)生。利妥昔單抗后疾病復(fù)發(fā)歸因于B細(xì)胞不完全耗盡，需要反復(fù)輸注利妥昔單抗來(lái)控制疾病，但慢性B細(xì)胞耗盡有嚴(yán)重感染的風(fēng)險(xiǎn)。理想情況下，治療應(yīng)僅消除致病的anti-MuSK B細(xì)胞，保留健康的B細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)MuSK MG的持久緩解，而不產(chǎn)生全身性的免疫抑制。
 

在這里，作者報(bào)道了一種嵌合自身抗體受體(CAAR)的設(shè)計(jì)和功能驗(yàn)證，該受體包含MuSK自身抗原，連接到串聯(lián)CD137-CD3ζ信號(hào)域。MuSK-CAAR在T細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)表達(dá)anti-MuSK表面自身抗體或B細(xì)胞受體(BCR)的B細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。MuSK-CAAR T細(xì)胞(MuSK-CAART)技術(shù)基于臨床批準(zhǔn)的抗CD19嵌合抗原受體T細(xì)胞(CART-19)療法，該療法已導(dǎo)致B細(xì)胞惡性腫瘤的完全和持久緩解。作者在臨床前模型中研究了MuSK-CAART的療效和安全性，這支持MuSK-CAART作為一種精確的細(xì)胞免疫療法，具有誘導(dǎo)MuSK MG完全和持久緩解的潛力。

 

主要結(jié)果部分：

1.MuSK-CAAR靶向疾病相關(guān)的抗MuSK B細(xì)胞表位

 

 

MuSK是一種跨膜酪氨酸激酶，其外域包括三個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域(Ig1-Ig3)和卷曲樣結(jié)構(gòu)域(Fz)。估計(jì)有100%, 58%和23%的MuSK MG患者的血清可以識(shí)別Ig1, Ig2和Ig3-Fz結(jié)構(gòu)域。為了靶向抗MuSK B細(xì)胞，作者設(shè)計(jì)了一個(gè)MuSK-CAAR，包含完整的MuSK外域，連接CD137-CD3ζ共刺激和激活域，并證實(shí)了在原代人T細(xì)胞上的表達(dá)(a, b)。
 

為了驗(yàn)證MuSK-CAART的細(xì)胞毒性，作者從3例MuSK MG患者或3只MuSK免疫小鼠中分離了表達(dá)抗MuSK結(jié)構(gòu)域特異性BCR的Nalm-6 B細(xì)胞。MuSK- CAART證明了Nalm-6細(xì)胞針對(duì)每個(gè)MuSK結(jié)構(gòu)域的特異性裂解，但不裂解Nalm-6細(xì)胞(c–g)。共培養(yǎng)24小時(shí)比共培養(yǎng)5小時(shí)特異性細(xì)胞毒性增加。在MuSK-CAART與抗MuSK Nalm-6共培養(yǎng)的上清液中檢測(cè)到IFNγ，但對(duì)照組未檢測(cè)到IFNγ (h)。

 

2. 可溶性抗MuSK抗體對(duì)MuSK-CAART細(xì)胞毒性、IFNγ產(chǎn)生和增殖的影響

 

 

MuSK自身抗體可能會(huì)阻斷MuSK- CAART與抗MuSK BCR的結(jié)合(漿細(xì)胞)，但它們也可能通過(guò)激活來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞毒性MuSK-CAART。MuSK- caart對(duì)混合靶細(xì)胞(13-3B5/3-28/24C10/192-8(抗ig1 /Ig2/Ig3/Fz))的細(xì)胞毒性被MuSK MG患者的多克隆IgG部分抑制，但特異性細(xì)胞毒性普遍隨著效應(yīng)靶比的增加和共孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增加（a）。當(dāng)與Nalm-6對(duì)照和來(lái)自MuSK MG患者的IgG一起培養(yǎng)時(shí)，MuSK- CAART和NTD-T產(chǎn)生同樣低水平的IFNγ(b，左)當(dāng)與抗musk Nalm-6細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，在MuSK-CAART中觀察到IFNγ相對(duì)于NTD-T(nontransdused)的產(chǎn)生(b，右，黑色和紅色條)。MG患者IgG 對(duì)IFNγ水平無(wú)明顯影響，盡管觀察到有較低水平的趨勢(shì)(b，右，紅條)。
 

為了確定抗MuSK抗體對(duì)MuSK-CAART的直接影響，將MuSK-CAART與抗MuSK單抗(13-3B5(抗Ig1)/3-28(抗Ig2)/24C10(抗Ig3)/192-8(抗fz))孵育。Anti-MuSK單抗(混合或單獨(dú))以濃度相關(guān)的方式誘導(dǎo)IFNγ的產(chǎn)生和MuSK-CAART的增殖(c, d)。

 

3. MuSK-CAART通過(guò)BCR靶向anti-MuSK B cell的效果與anti-CD19 CART介導(dǎo)的cell溶解相當(dāng)

 

 

生物發(fā)光成像表明，相對(duì)于NDT-T, CART-19和MuSK-CAART顯著降低了Nalm-6的生長(zhǎng)(a, b)，盡管在MuSK-CAART治療和CART-19治療的一小部分小鼠中觀察到生物發(fā)光通量信號(hào)的復(fù)發(fā)。在移植了Nalm-6 13-3B5細(xì)胞的CART -19處理小鼠中，Nalm-6的復(fù)發(fā)不是由于T細(xì)胞的丟失，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)CART-19處理的小鼠中都可以檢測(cè)到T細(xì)胞(c)。
 

在混合Nalm-6和13- 3b5移植的小鼠中觀察到更高的MuSK-CAART百分比(c)，可能是由于可溶性單克隆抗體誘導(dǎo)的MuSK-CAART在靶細(xì)胞遭遇后在體內(nèi)擴(kuò)增或增殖。與MuSK-CAART輸注產(chǎn)物相比，脾臟分離的T細(xì)胞中MuSK-CAART的表達(dá)保持穩(wěn)定(d)。然而，與CART-19輸注產(chǎn)物相比，脾臟T細(xì)胞中的抗CD19 CAR表達(dá)較低(d)，這可能解釋了CART-19治療小鼠中Nalm-6復(fù)發(fā)的原因。
 

在13- 3b5異種移植小鼠中，NTD-T處理小鼠的抗MuSK抗體滴度在第5天至第15天增加，而CART-19和MuSK-CAART處理小鼠的滴度在T細(xì)胞注射后第15天和第11天明顯低于NTD-T處理小鼠(e)。與NTD-T處理的小鼠相比，CART-19-和MuSK-CAART處理的小鼠與膈肌細(xì)胞結(jié)合的抗MuSK IgG也減少(f)。
 

綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，MuSK-CAART可以靶向MuSK Ig1/Ig2/Ig3/Fz結(jié)構(gòu)域特異性細(xì)胞具有與CART-19相當(dāng)?shù)寞熜А?/p>

 

4. 在MuSK EAMG模型中，MuSK-CAART降低Anti-MuSK的IgG，但不降低總IgG

 

 

治療后，1D3-CART治療小鼠的脾臟和淋巴結(jié)中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到B細(xì)胞，而NTD-T和MuSK-CAART治療小鼠的B細(xì)胞頻率相當(dāng)(b)�？筂uSK抗體滴度在治療前各組間具有可比性(c)， NTD-T治療小鼠的抗MuSK抗體滴度逐漸升高，而MuSK- CAART-和1D3 -CART治療小鼠的滴度在注射后1周開(kāi)始顯著降低(d)。與1D3-CART顯著降低血清總IgG不同，相對(duì)于NTD-T處理的小鼠，MuSK-CAART沒(méi)有降低血清總IgG水平(e)。
 

CD45.1+ T細(xì)胞在脾臟和淋巴結(jié)中發(fā)現(xiàn)MuSK-CAART-treated T細(xì)胞比例相對(duì)較低的小鼠,和更高的T細(xì)胞比例在1D3-CART-treated小鼠,后者在一定程度上由于兩個(gè)更多的T細(xì)胞注射在組1中,除了罕見(jiàn)的anti-MuSK B細(xì)胞相對(duì)于CD19-expressing B細(xì)胞免疫小鼠和/或不同的信號(hào)和costimulatory域MuSK-CAAR和1D3-CAR(f)。
 

另外，作者還檢測(cè)了MuSK-CAART的脫靶細(xì)胞毒性和對(duì)肌肉的脫靶效應(yīng)，均未觀察到。

 

模式圖：

 

 

最后，針對(duì)文章的研究，小優(yōu)博士在這里制作了一張模式圖，供大家參考。雖然MuSK-CAART和CART均靶向漿細(xì)胞上的BCR復(fù)合體結(jié)合并殺傷漿細(xì)胞，但MuSK-CAART嵌合的是自身抗原MuSK受體，與BCR可變區(qū)特異性結(jié)合，僅僅殺傷針對(duì)MuSK產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞，與CART（嵌合抗體受體，殺傷所有漿細(xì)胞）相比，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。因此CAART作為CART反向構(gòu)思的結(jié)果，在針對(duì)自身免疫性疾病方面具有潛在的巨大的研究?jī)r(jià)值。