細胞遺傳學的檢測分析可以幫助我們了解染色體的變異，進而對相關(guān)疾病更深入的了解。染色體的異�？赡軐е禄�因表達的失調(diào)或產(chǎn)生新的突變蛋白，從而構(gòu)成癌癥、不孕癥和各種先天性疾病(如唐氏綜合征)。非整倍體、缺失、重復和重排等都屬于染色體異常的類型，再比如基因組拷貝數(shù)變異（copy number variation， CNV），是遺傳病和出生缺陷的重要原因之一。
 

核型分析（Karyotyping）是一種傳統(tǒng)的細胞遺傳學研究方法，該方法可以用來識別主要的染色體異常，如單體、多體、染色體重排以及大片段缺失或重復。然而，該方法受限于低分辨率和較窄的目標范圍，因此只能檢測較大的染色體變化(通常為> 5 Mb)。此外，它是一種主觀技術(shù)，因此異常的檢測通常依賴于分析人員的專業(yè)知識。
 

熒光原位雜交技術(shù)（FISH）和微整列比較基因組雜交（aCGH）可以對染色體和基因組結(jié)構(gòu)做進一步的分析，接下來就為大家介紹一下兩種技術(shù)和各自的應(yīng)用：

 

熒光原位雜交技術(shù)（FISH）

FISH是一項分子細胞生物學技術(shù)，廣泛用于檢測和定位細胞中的DNA序列。該技術(shù)應(yīng)用特異性的熒光標記探針與染色體或核酸樣本進行雜交，通過熒光顯微鏡實現(xiàn)目標DNA或RNA序列的可視化。

實現(xiàn)FISH技術(shù)主要包括以下的幾步驟：

1.樣本制備階段：提取細胞或組織樣本，通過固定和制片的過程使樣本處于適合雜交的狀態(tài)。需要根據(jù)不同的樣本類型選擇不同的預處理方式：

●細胞或組織的固定

●脫蠟(FFPE組織)

●抗原的修復

●酶促透化作用

 

2.雜交：將熒光標記的DNA/RNA探針加入到制備好的樣本上，并在特定的條件下促進探針與目標序列的雜交。

 

2.1 Nick Translation自己設(shè)計RNA/DNA探針

RNA/DNA探針可以選擇自己設(shè)計和合成，這項技術(shù)稱為Nick Translation（切口平移）主要的操作流程如下：

使用Nick translation DNA Labeling kit(ENZ-GEN111)標記TP53 BAC DNA探針的Orange 552 dUTP (ENZ-42842)和著絲粒17 BAC DNA探針的Green 496 dUTP (ENZ-42831)。標記探針與中期擴散雜交。

 

2.2 即用型DNA/RNA探針

目前市面上有提供很多ready-to-use型的RNA/DNA探針，可直接用于檢測目標基因，省去了自己制備的步驟。比如針對HPV病毒、經(jīng)典的腫瘤靶點（EGFR）、GADPH以及泛素化等等常用病理靶點

 

也有可以同時檢測四個不同靶點的探針試劑盒，如下圖所示，是在正常細胞和染色體異常的細胞中對CKDN2A、CEN3、CEN7、CEN17這四種基因（膀胱癌常見變異基因）同時檢測后的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)CEN3、CEN7、CEN17三種基因在不正常細胞中數(shù)量有增多

 

3.顯色：

與免疫組化類似，偶聯(lián)了熒光標記之后，需要加入顯色劑進行后續(xù)的檢測，顯色劑有操作簡便的“一步法”試劑，或當樣本豐度較低時或希望獲得更低背景的結(jié)果時，有“兩步法”試劑。“兩步法”檢測試劑其實就是在RNA/DNA探針上偶聯(lián)一個anti-biotin或anti-digoxin的信號放大試劑，然后再加入對應(yīng)的顯色試劑。

Figure. 顯色試劑的兩種檢測方法，一步法（左）兩步法（右）

 

4.檢測：最后通過熒光顯微鏡觀察及攝影，分析熒光信號的分布和強度，就可以確定目標序列的存在與位置。

 

FISH技術(shù)由于其精確性，被廣泛應(yīng)用于以下幾個領(lǐng)域：

1. 染色體異常檢測：用以檢測染色體結(jié)構(gòu)的畸變，如易位、缺失、復制及非整倍性等。

2. 基因定位與映射：確定特定基因在染色體上的精確位置。

3. 染色體結(jié)構(gòu)研究：觀察染色體結(jié)構(gòu)變化，及在細胞周期中的動態(tài)變化。

 

FISH技術(shù)有如下的幾個優(yōu)點：

1. 高分辨率：FISH能夠在單個細胞層面上進行檢測，實現(xiàn)精確定位。

2. 操作靈活性：可用于多種樣本類型，包括冰凍、石蠟包埋組織及活細胞。

3. 多色標記：可同時使用多種不同顏色的探針對多個目標進行檢測。

 

當然，F(xiàn)ISH技術(shù)也存在一定的局限性：

1. 對目標序列的依賴性：需要預先知道目標DNA或RNA序列才能設(shè)計相應(yīng)的探針。

2. 操作復雜性：過程較為繁瑣，包括樣本制備、探針制備和信號檢測等，需要經(jīng)驗較豐富的操作人員。

3. 儀器要求：需使用昂貴的熒光顯微鏡，并對顯微鏡操作有一定要求。

 

微陣列比較基因組雜交（aCGH）技術(shù)

aCGH技術(shù)是檢測與染色體異常相關(guān)的基因拷貝數(shù)增加和拷貝數(shù)丟失的有力工具。與其他技術(shù)(如FISH和G-banding karyotyping)相比，aCGH檢測染色體畸變更快、更穩(wěn)定、結(jié)果更優(yōu)越，從而能夠更好地了解染色體變化在遺傳性疾病和癌癥中的作用。
 

CGH是通過將實驗樣本和對照樣本的DNA用紅綠熒光標記之后，然后與芯片進行雜交之后，借用專門的數(shù)據(jù)分析軟件檢測紅綠熒光的比值，將兩個樣本間的DNA拷貝數(shù)變化進行比較，最終得出實驗樣本的DNA拷貝數(shù)是減少還是增加。該技術(shù)的具體步驟如下圖所示：

 

Figure. aCGH技術(shù)實驗步驟（圖源來自：10.1007/s10072-016-2658-y）

 

步驟一：抽提樣本的DNA，并分別將對照樣本和實驗樣本的DNA進行黃綠熒光的標記

Figure Four replicate 500-ng DNA samples were labeled with Enzo’s CYTAG® CGH Labeling Kit（ENZ-42671）for Oligo Arrays or leading competitor’s kits. Enzo’s proprietary labeling technology generates the highest specific activity of labeling.

 

步驟二：將標記之后的DNA混合并與芯片雜交

步驟三：用熒光掃描儀讀取芯片上的熒光信號

步驟四：通過相關(guān)分析軟件，分析熒光信號并識別拷貝數(shù)的增加或減少
 

通過陣列分析軟件計算熒光的log2比率(Cy5/Cy3)，通過這種方式，可以識別DNA中的缺失或重復。與對照樣本相比，在染色體的特定區(qū)域中，如果實驗樣本顏色的強度較高，表明該區(qū)域的DNA增多，而如果對照樣本顏色的強度較高，表明該特定區(qū)域的DNA丟失。中性色表示兩個樣品在此片段無差異，所以是正常狀態(tài)。
 

 

在臨床上，以aCGH技術(shù)和SNP技術(shù)向結(jié)合為基礎(chǔ)的染色體微陣列分析技術(shù)已成功在產(chǎn)前診斷中有所應(yīng)用

Figure. 對3677名高齡產(chǎn)婦進行a-CGH產(chǎn)前診斷，染色體異常在不同高齡孕婦中的具體分布表格，來源：doi: 10.12182/20210160601

 

使用CGH技術(shù)可以測定整個基因組，且無需細胞培養(yǎng)；但不能檢測平衡的染色體改變-，且該實驗技術(shù)需要較高質(zhì)量的DNA樣本
 

兩種技術(shù)都為現(xiàn)代遺傳學研究提供了獨特的工具，盡管它們在原理和應(yīng)用上有所不同，但都是評估基因組結(jié)構(gòu)變化不可或缺的方法。FISH以其高精度和靈活性在定位染色體的特定區(qū)域上顯得無可替代，而CGH則在全基因組分析方面展現(xiàn)了強大的能力。
 

	FISH	CGH
敏感性	通過使用熒光探針對特定的基因或染色體區(qū)域進行定位，因此在檢測具體基因突變或特定染色體異常方面非常敏感。	CGH適用于檢測DNA全基因組水平的拷貝數(shù)變異（CNV）。雖然它對拷貝數(shù)改變非常敏感，但沒有FISH那樣可以達到單個基因或小片段精度的能力。
特異性	探針設(shè)計的特異性決定了FISH檢測的準確度，正確設(shè)計的探針可以精確標記目標序列，從而提供高特異性的檢測結(jié)果。	CGH能夠比較樣本整體基因組與參考基因組之間的差異，從而確定拷貝數(shù)增加或減少，但無法提供FISH所提供的確切染色體定位信息。
應(yīng)用類型	1. 單基因或特定染色體區(qū)域的病理研究。 2. 診斷特定的染色體異常，如染色體斷裂和易位。 3. 遺傳性疾病和癌癥中染色體畸形的診斷。	1. 全基因組水平的拷貝數(shù)變異檢測。 2. 腫瘤基因組的全面分析，以發(fā)現(xiàn)腫瘤驅(qū)動基因的變異。 3. 檢測整個基因組的遺傳異質(zhì)性。
技術(shù)選擇建議	若研究需要定量分析特定基因或染色體區(qū)域的變化，F(xiàn)ISH是一個更好的選擇	若研究關(guān)注于全基因組水平的變化或需要篩查未知的基因變化，CGH能提供更全面的信息

表. FISH技術(shù)和CGH技術(shù)的對比