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三維細(xì)胞培養(yǎng)FiberCell系統(tǒng)的基礎(chǔ)認(rèn)識詳解

瀏覽次數(shù):759 發(fā)布日期:2023-7-17  來源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)
題記:
細(xì)胞培養(yǎng)的維度提升到三維,更加能夠模擬體內(nèi)細(xì)胞的生長環(huán)境。圍繞細(xì)胞的三維培養(yǎng)也涌現(xiàn)了很多新鮮的產(chǎn)品,生物工藝開發(fā)、優(yōu)化和放大已經(jīng)成為主流趨勢。其中在細(xì)胞培養(yǎng)灌流工藝中,營養(yǎng)物質(zhì)被不斷加入到生物反應(yīng)器中,與此同時細(xì)胞生長代謝的產(chǎn)物通過截留裝置與目的產(chǎn)物分離,可以保證細(xì)胞一直處于最佳的生長環(huán)境中,從而獲得高細(xì)胞密度或高濃度細(xì)胞產(chǎn)物。中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(FiberCell系統(tǒng))是一種可以在常規(guī)實驗室內(nèi)實現(xiàn)生物工藝放大中的小試生產(chǎn)高濃度細(xì)胞產(chǎn)物,可以滿足基礎(chǔ)科研中蛋白生產(chǎn)、外泌體富集、藥代學(xué)/藥動學(xué)等研究。充分利用系統(tǒng)的優(yōu)勢,為實驗室研究“降本增效”。
 
圖1 FiberCell系統(tǒng)置于培養(yǎng)箱內(nèi)的實物圖
 

FiberCell系統(tǒng)工作原理

● 蠕動泵、培養(yǎng)筒、培養(yǎng)基儲液瓶通過導(dǎo)管連接構(gòu)成一個連續(xù)流動的體系。
● 中空纖維作用類似于微血管,纖維直徑大約200 μm,可選擇不同截留分子量的纖維。
● 培養(yǎng)基在中空纖維內(nèi)部循環(huán)流動,細(xì)胞接種培養(yǎng)在纖維外部;中空纖維可允許小分子營養(yǎng)物質(zhì)自由穿透。
● 細(xì)胞在纖維外生長時,分泌的產(chǎn)物聚集在纖維外空間,濃度可高于2D培養(yǎng)的10-100倍。
 
圖2 FiberCell系統(tǒng)運(yùn)行動態(tài)圖

FiberCell系統(tǒng)熱門應(yīng)用舉例

外泌體富集
Yan等利用FiberCell系統(tǒng)進(jìn)行3D培養(yǎng)臍帶MSC收獲外泌體,再與2D培養(yǎng)獲得的外泌體進(jìn)行動物臨床研究比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3D-外泌體的產(chǎn)量是2D-外泌體的7.5倍;體外研究表明兩種方式獲得的外泌體均能刺激軟骨細(xì)胞增殖、遷移和機(jī)制合成,抑制細(xì)胞凋亡,其中3D-外泌體的作用強(qiáng)于2D-外泌體,治療效果更好。
 
圖3 FiberCell系統(tǒng)高產(chǎn)外泌體(左);不同培養(yǎng)方式獲得的外泌體在軟骨缺損修復(fù)中的治療效果比較(右)

單抗或重組蛋白生產(chǎn)
實驗室內(nèi)通過動物模型收獲小鼠腹水再純化獲取單克隆抗體,生產(chǎn)規(guī)模小,周期長,動物個體的差異也會導(dǎo)致蛋白的差異。如何在有限空間與時間內(nèi)達(dá)到小規(guī);蛘呱虡I(yè)化地生產(chǎn)單克隆抗體或者重組蛋白來滿足科學(xué)研究,F(xiàn)iberCell系統(tǒng)可在培養(yǎng)箱內(nèi)實現(xiàn)小規(guī)模持續(xù)生產(chǎn),大大縮短生產(chǎn)周期與純化成本。另外搭配無蛋白、化學(xué)合成的血清替代物CDM-HD,提高表達(dá)蛋白的純度與一致性。
 
圖4 SDS-PAGE分析上清中重組蛋白M5114的表達(dá)情況
 

體外PK/PD模型

體外PK/PD模型是指借助體外裝置來模擬藥物在體內(nèi)的藥代動力學(xué)過程和藥效動力學(xué)的研究方法。與傳統(tǒng)的抗菌藥物藥效學(xué)研究方法相比,該模型能夠直接體現(xiàn)體內(nèi)抗菌藥物動態(tài)變化過程中與細(xì)菌或細(xì)胞的相互作用,且不受實驗動物的限制。FiberCell系統(tǒng)可以實現(xiàn)單一藥物或同時兩種藥物的PK/PD模型,更精確地監(jiān)控劑量和代謝狀況。歐洲藥品管理局(EMA)已批準(zhǔn)中空纖維感染模型用于體外毒性測試,得到的抗生素藥物數(shù)據(jù)可以直接用于臨床申報。
 
圖5 FiberCell系統(tǒng)用于體外PK/PD模型的模式圖

FiberCell系統(tǒng)常見問題

1、FiberCell相比于T型Flasks、滾瓶、培養(yǎng)袋的優(yōu)勢在哪里?

FiberCell系統(tǒng)可以良好地模擬哺乳動物體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)應(yīng)用,體外運(yùn)行可以讓研究更簡單、更高效、更具成本效益。當(dāng)然以低密度懸浮培養(yǎng)或二維燒瓶為基礎(chǔ)的研究,血清體系的使用并不是真正生理性質(zhì)的,對二維培養(yǎng)是較為適用的,但缺乏生物學(xué)相關(guān)的特性,也不是細(xì)胞最佳的生長方式。而FiberCell系統(tǒng)在體外提供了一個更加接近于體內(nèi)的三維環(huán)境,可持續(xù)收獲產(chǎn)物用于下游研究,有效改善蛋白質(zhì)折疊與均勻的翻譯后修飾,可高效表達(dá)蛋白。
圖6 培養(yǎng)相同細(xì)胞量時消耗的T Flasks與FiberCell系統(tǒng)的比較

2、FiberCell系統(tǒng)該使用什么培養(yǎng)體系?如何適應(yīng)無血清培養(yǎng)基?

1) FiberCell系統(tǒng)擁有“高密度細(xì)胞培養(yǎng)、收獲高濃度細(xì)胞產(chǎn)物”的特點,例C2011型號的培養(yǎng)筒至少需要接種1*10^8 cell,這些細(xì)胞在系統(tǒng)內(nèi)會形成它們自己的微環(huán)境,建議高密度細(xì)胞培養(yǎng)時,基礎(chǔ)培養(yǎng)基的葡萄糖含量至少為3.5 g/L,若是1.0 g/L低糖水平很難維持。

2) 使用基礎(chǔ)培養(yǎng)基加血清可以在中央儲液室中運(yùn)行,即纖維內(nèi)空間進(jìn)行循環(huán)以提供給纖維外空間細(xì)胞相關(guān)營養(yǎng)物質(zhì)等。如果需要排除血清外源性蛋白或外泌體等干擾,請在細(xì)胞穩(wěn)定消耗葡萄糖后,緩慢撤去血清或緩慢轉(zhuǎn)換添加CDM-HD(Chemically Defined Medium-High Density)等無血清添加物。待細(xì)胞適應(yīng)新培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基后,可以開展相關(guān)產(chǎn)物的收獲。

3、若細(xì)胞狀態(tài)不佳,是否可以重復(fù)使用培養(yǎng)筒或在同一培養(yǎng)內(nèi)重新接種細(xì)胞嗎?

1) 培養(yǎng)筒如果沒有發(fā)生污染,可以嘗試同一培養(yǎng)筒內(nèi)重新接種同類細(xì)胞,但需要在接種前將狀態(tài)不佳的細(xì)胞清除,使用物理吹打方式或胰酶消化方式均可行,暫時無法保證細(xì)胞是否清除徹底。

2) 重新接種細(xì)胞后,仍需要正常監(jiān)測細(xì)胞消耗葡萄糖的情況。如能夠正常消耗,可繼續(xù)開展收獲工作;如不能正常消耗,則需要更換新的培養(yǎng)筒。

3) 培養(yǎng)筒不建議高壓滅菌。

4、關(guān)于FiberCell系統(tǒng)培養(yǎng)基顏色變化的情況說明。

1) 當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖水平下降到50%以后,產(chǎn)生很多細(xì)胞代謝廢物或乳酸等,培養(yǎng)基的顏色會變成淡黃色或橘黃色需及時更換中央儲液室的培養(yǎng)基。

2) 當(dāng)培養(yǎng)基的顏色變?yōu)樯罴t色,需要了解下培養(yǎng)箱的CO2濃度是否正確。

3) 如果系統(tǒng)的內(nèi)外空間培養(yǎng)基顏色都變黃、粉色或渾濁,或者在纖維外空間的接口處出現(xiàn)白色絲狀物等,可能存在細(xì)菌或真菌污染,需要舍棄該套培養(yǎng)筒。

5、關(guān)于FiberCell系統(tǒng)中培養(yǎng)筒的使用壽命的說明。

1) FiberCell系統(tǒng)應(yīng)用在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)持續(xù)時間為560天。另外應(yīng)用在雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng),近一年的收獲的抗體特征基本無變化。

2) 可嘗試每周至少一次反向過濾收獲的操作,有助于纖維孔徑的通暢。

3) 時刻注意無菌操作,一旦發(fā)生微生物污染,培養(yǎng)筒就需要舍棄。

*更多關(guān)于FiberCell系統(tǒng)的FAQ可以咨詢逍鵬生物技術(shù)支持。

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