文章原創(chuàng)為：FACSelite 文章來源于：流式通

一般免疫亞群分析
General Immune Subset Profiling

流式細(xì)胞術(shù)常用于監(jiān)測治療或疾病進(jìn)程對外周血細(xì)胞亞群和蛋白表達(dá)的影響，即免疫監(jiān)測。該技術(shù)涉及表面蛋白標(biāo)記，以評估成熟細(xì)胞亞群。更深入的分析可結(jié)合細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子。對于高參數(shù)檢測，推薦參考Cytometry Part B發(fā)布的OMIPs方案。

01.骨干標(biāo)記
Backbone Markers

全血的一般骨干標(biāo)記包括：

• CD34：造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞
• CD45：泛造血系標(biāo)記
• CD15或CD66b：PMN-MDSC，中性粒細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞
• CD14或CD33/CD11c：單核細(xì)胞
• CD19：B細(xì)胞
• CD56：NK和NKT細(xì)胞
• CD3：T細(xì)胞
• CD127：ILC
• CD123：漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞
• TCRV α7.2：MAIT細(xì)胞
• CD117：肥大細(xì)胞

包含CD34的目的是為了從分析中排除祖細(xì)胞，如果應(yīng)用是白血病或其他血液相關(guān)惡性腫瘤，這可能非常重要，因?yàn)檫@些疾病是由淋巴母細(xì)胞的異常分裂引起的。同樣，如果通過Ficoll分離去除了像中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞這樣的多形核細(xì)胞，可能不需要CD66b或CD15。對于單核細(xì)胞的標(biāo)記表型，另一種替代組合是使用CD33或CD64，而不是或除了CD14。

02.T淋巴細(xì)胞
T Lymphocytes

T淋巴細(xì)胞分類概覽：

T淋巴細(xì)胞的分類基于CD3陽性，并排除CD34、CD19和CD14。為了區(qū)分特定的T細(xì)胞亞群，需要檢測以下標(biāo)記：

• γδ T細(xì)胞：γδTCR
• MAIT細(xì)胞：TCRV α7.2
• NKT細(xì)胞：TCRVα24-Jα18

CD56用于排除NKT和NK細(xì)胞，但需注意其在MAIT和γδT細(xì)胞上可能呈陽性或陰性。在分析時，應(yīng)先對γδTCR、TCRV α7.2和TCRVα24-Jα18進(jìn)行門控，再對CD56進(jìn)行門控，以確保αβ T細(xì)胞的純凈度。

T細(xì)胞亞群的進(jìn)一步分類：

CD4和CD8定義了T細(xì)胞的單陽性和雙陽性亞群，并通過以下標(biāo)記的表達(dá)進(jìn)一步區(qū)分為幼稚、效應(yīng)或記憶狀態(tài)：

• CD197
• CD45RA
• CD27
• CD28

CD4+輔助性（Th）和CD8+細(xì)胞毒性（CTL或Tc）T細(xì)胞亞群通過以下組合來識別：

• CCR10
• CD183/CXCR3
• CD185/CXCR5
• CD194/CCR4
• CD196/CCR6

這些表面標(biāo)記最好與細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子或核轉(zhuǎn)錄因子的功能標(biāo)記相結(jié)合，以增強(qiáng)分析的準(zhǔn)確性。

特殊T細(xì)胞亞群：

T輔助濾泡（Tfh）細(xì)胞主要位于B細(xì)胞濾泡中心，由CXCR5+定義。濾泡調(diào)節(jié)性T（Tfr）細(xì)胞在表達(dá)CXCR5+方面與Tfh相似，但功能不同，主要調(diào)節(jié)B細(xì)胞的抗體反應(yīng)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）通常由CD25+/CD127lo/-定義，而Tfr細(xì)胞CD25/CD127的表達(dá)類似于Tregs。這些亞群的功能表型需要細(xì)胞因子或轉(zhuǎn)錄因子標(biāo)記來進(jìn)一步確認(rèn)。先天淋巴細(xì)胞可能表達(dá)與T輔助和細(xì)胞毒性T細(xì)胞亞群相似的細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子譜。

03.自然殺傷細(xì)胞亞群標(biāo)記
Natural Killer Subset Markers

自然殺傷（NK）細(xì)胞與NKT細(xì)胞的區(qū)別在于NK細(xì)胞不表達(dá)CD3，而CD94+有助于確認(rèn)NK細(xì)胞的身份。NK細(xì)胞的進(jìn)一步分類為成熟NK（NK1）、終末NK（NK2）和早期NK（NK3）依賴于CD56 (bright vs dim)、CD127、CD16和CD57的表達(dá)水平和模式。由于某些先天淋巴細(xì)胞也可能表達(dá)CD56，因此區(qū)分CD3-/CD127+的先天淋巴細(xì)胞（ILC）和CD3-/CD127lo/-的NK細(xì)胞是必要的。

04.單核細(xì)胞
Monocytes

單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞概述：

- 單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，具有適應(yīng)性和先天性免疫功能，主要負(fù)責(zé)清除微生物、腫瘤細(xì)胞和死亡細(xì)胞碎片。

- 單核細(xì)胞循環(huán)于血液中，而巨噬細(xì)胞主要駐留于組織中。

- 監(jiān)測巨噬細(xì)胞時，可使用CD80（M1型）和CD206（M2型）標(biāo)記。

單核細(xì)胞分類：

- 單核細(xì)胞約占白細(xì)胞的10%，通過CD3-/CD14+/CD11c+標(biāo)記定義。

- 根據(jù)CD16和HLA-DR的表達(dá)水平，單核細(xì)胞分為三類：

• 經(jīng)典型：(CD14 hi/CD16-/HLA-DR lo/CD11c lo)
• 中間型：(CD14 hi/CD16+/hi/ HLA-DR hi/ CD11c hi)
• 非經(jīng)典型：(CD14 low/CD16 hi/ HLA-DR+/ CD11c hi)

- HLA-DR的檢測有助于排除髓系來源的MSDC（Mo-MDSC），這些細(xì)胞表達(dá)CD3-/CD14+/CD16+/-HLA-DR-。

單核細(xì)胞功能：
- 經(jīng)典型單核細(xì)胞占外周血中單核細(xì)胞的80-90%，具有抗微生物和促炎功能，能分泌活性氧和IL-10，并可分化為Mo-MDSC。
- 中間型單核細(xì)胞主要負(fù)責(zé)抗原呈遞和凋亡調(diào)節(jié)。
- 非經(jīng)典型單核細(xì)胞參與抗病毒反應(yīng)和Fc受體介導(dǎo)的吞噬作用，通過CX3CR1在血管中巡邏并招募MHC II+細(xì)胞。
- 激活后，中間型和非經(jīng)典型單核細(xì)胞分泌炎癥細(xì)胞因子，如IL-6、TNF-alpha和IL-1 beta。
- 經(jīng)典型和中間型單核細(xì)胞在功能上協(xié)同作用，受CCR2和CCR5指導(dǎo)侵入組織，分化為巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞，并表達(dá)MHCII以激活T細(xì)胞。

05.B細(xì)胞
B cells

B淋巴細(xì)胞概述：
- B淋巴細(xì)胞是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵成員，通過CD45+/CD3-/CD19+的標(biāo)記來識別。
- CD19比CD20更受青睞，因?yàn)樗�是B細(xì)胞祖細(xì)胞上首先表達(dá)的特異性標(biāo)記，而CD20在抗體分泌細(xì)胞（如漿細(xì)胞和漿細(xì)胞前體細(xì)胞）上會丟失。
- B細(xì)胞高度異質(zhì)化，需要產(chǎn)生多樣化的抗原受體（BCR）以及記憶、天真和效應(yīng)亞群。
- 類別轉(zhuǎn)換是激活的B細(xì)胞改變其重鏈類型（從IgM和IgD到IgG、IgE或IgA）的過程，以優(yōu)化對特定病原體的體液免疫反應(yīng)，不影響抗體的特異性，只影響其效應(yīng)功能。
- B細(xì)胞和T細(xì)胞受體的特異性在V(D)J重組過程中確定。

B細(xì)胞亞群的識別：
- 在B細(xì)胞特異性方案中，常用CD20、CD10、CD5、CD27、CD38、IgD、IgM、CD24的組合。
- 在一般免疫分析中，通過CD10、CD27和IgD的組合來區(qū)分記憶B細(xì)胞亞群。

B細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)：
- CD27在約40%的外周B細(xì)胞中表達(dá)，是B細(xì)胞具有抗原特異性記憶和產(chǎn)生免疫球蛋白能力的標(biāo)記，其在漿細(xì)胞抗體分泌細(xì)胞（ASC）上的表達(dá)增加。
- 存在一個CD27-的B記憶細(xì)胞亞群，稱為雙陰性（DN）細(xì)胞，其功能仍在研究中。
- CD10是指示淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞命運(yùn)祖細(xì)胞分化程度和譜系承諾的標(biāo)記。
- 在B細(xì)胞發(fā)育中，IgM首先在骨髓中的Pre-B II祖細(xì)胞上表達(dá)，而B細(xì)胞在離開骨髓成為過渡B細(xì)胞后才表達(dá)細(xì)胞表面IgD。

06.粒細(xì)胞
Granulocytes

粒細(xì)胞是白細(xì)胞的一種，以其多葉核（多形核）、體積大（高前向散射FSC）和含有的蛋白質(zhì)及酶顆粒（高側(cè)向散射SSC）為特征。粒細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。在流式細(xì)胞術(shù)中，嗜堿性粒細(xì)胞與中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞有顯著差異。

嗜堿性粒細(xì)胞：

• 嗜堿性粒細(xì)胞的散射特征較低，可能與單核細(xì)胞相似。
• 它們表達(dá)CD15或CD66b的水平低或不表達(dá)。
• 嗜堿性粒細(xì)胞的基本標(biāo)記表型為CD45 lo/ CD3-/ CD14-/ CD66b-/CD123 hi。
• 嗜堿性粒細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDC）會落入同一群體，因此CD303+和HLA-DR+用于進(jìn)一步定義pDC，而FcεR1a+用于定義嗜堿性粒細(xì)胞。
• 嗜堿性粒細(xì)胞占所有白細(xì)胞的1%，它們吞噬外來微生物，通過釋放組胺調(diào)節(jié)過敏反應(yīng)，通過釋放肝素調(diào)節(jié)血液凝固。

中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞：

• 這兩種細(xì)胞表達(dá)CD15和CD66b。
• PMN-MDSC也表達(dá)CD15+/CD66b+，因此CD117+/Lox-1-可以識別中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，而CD177-/Lox-1+可以識別PMN-MDSC。
• 中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞可以通過CD16和CD193的表達(dá)差異來區(qū)分。
• 中性粒細(xì)胞是感染的第一反應(yīng)者，通過吞噬作用和吞噬體中的酶降解來破壞病原體。

嗜酸性粒細(xì)胞：

• 嗜酸性粒細(xì)胞占白細(xì)胞的1-5%，具有雙葉核。
• 它們主要在血液循環(huán)或身體的脂肪組織中，保護(hù)身體免受寄生蟲感染。
• 嗜酸性粒細(xì)胞遷移到炎癥部位，并在寄生蟲感染時釋放含有麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）、嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白（ECP）、嗜酸性粒細(xì)胞衍生神經(jīng)毒素（EDN）和促紅細(xì)胞生成素（EPO）的顆粒。
• 這些細(xì)胞毒性蛋白混合物可以對感染周圍的組織造成重大損害。
• 嗜酸性粒細(xì)胞可以通過CD193+來確認(rèn)。

肥大細(xì)胞：

• 與嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞一樣，肥大細(xì)胞（MC）也對FcεRIa陽性，這是一種結(jié)合單體IgE的表面受體。
• 骨干標(biāo)記中包含CD117有助于通過其CD123-/ CD117 hi來表型肥大細(xì)胞，與其他CD3-/CD14-亞群相比較。

總結(jié)
Conclusion

流式細(xì)胞術(shù)中的免疫監(jiān)測或免疫分析主要用于監(jiān)測人類外周血中細(xì)胞亞群和蛋白表達(dá)的變化，涉及多種免疫細(xì)胞的表面標(biāo)記，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞等，以評估疾病進(jìn)程或治療效果。