子宮內(nèi)膜是子宮的黏膜內(nèi)層，它在整個生殖生命周期中經(jīng)歷脫落、再生和分化的動態(tài)、周期性變化。子宮內(nèi)膜功能異常常引發(fā)許多疾�。ò�括異常子宮出血、不孕癥、流產(chǎn)、先兆子癇、子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜癌），這些疾病極大的影響了女性健康。因此，繪制人類子宮內(nèi)膜時空動態(tài)圖譜、研究人類月經(jīng)周期中調(diào)節(jié)細胞分化的機制顯得尤為重要。

       2022年1月，來自英國劍橋大學(xué)的研究人員們在國際權(quán)威期刊Nature genetics上發(fā)表了題為 mapping the temporal and spatial dynamics of the human endometrium in vivo and in vitro 的研究論文，該文利用了10 x Genomics 公司的高通量scRNA-seq和Visium空間基因表達解決方案，繪制了人子宮內(nèi)膜細胞的時空圖譜，為后續(xù)人類攻克子宮內(nèi)膜異位癥以及子宮內(nèi)膜癌等子宮內(nèi)膜相關(guān)疾病奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。


文章結(jié)果

1. 人類子宮的全層單細胞圖譜

      為了生成人類子宮內(nèi)膜細胞的時空圖譜，研究者通過使用10x Genomics的單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法（Visium）來分析所有的子宮樣本。來自 15 個個體的 98,568 個細胞進行降維聚類分析后得到14個簇，并分成五種主要的細胞類型。來自另外四個增殖期子宮內(nèi)膜全層樣本的 snRNA-seq 數(shù)據(jù)證實了在增殖期發(fā)現(xiàn)的細胞群體。同時研究者使用 Visium 空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測了兩個個體的增殖期和分泌期的四個全層子宮樣本。
       整合單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)后，研究者發(fā)現(xiàn)PVSTEAP4僅存在于子宮內(nèi)膜中，而成纖維細胞 C7 在增殖期和分泌期都富含于子宮內(nèi)膜的基底層中�？傊�，本研究得到了子宮的全層單細胞圖譜及其在子宮內(nèi)膜和子宮肌層中的細胞位置的綜合圖譜。

2. 子宮內(nèi)膜上皮細胞的時空圖譜

       子宮內(nèi)膜上皮細胞可被分為兩個譜系，即分泌型和纖毛型。上皮細胞根據(jù)其標(biāo)志物表達分為四個主要群體：（1）SOX9 細胞群 (2)纖毛細胞(3) 管腔細胞 (4) 腺細胞 ；scRNA-seq 可將SOX9細胞群細分為三個細胞亞群。通過整合 scRNA-seq 和 Visium 數(shù)據(jù)，研究者定義了SOX9 三個子亞群的空間信息，利用RNA scope 探針做的單分子熒光原位雜交實驗（smFISH）驗證了 Visium 數(shù)據(jù)。


3 子宮內(nèi)膜疾病中的 SOX9+ 上皮細胞 

      利用TCGA 數(shù)據(jù)庫中的bulk RNA 測序數(shù)據(jù)，研究者發(fā)現(xiàn)SOX9+上皮細胞群在腫瘤中占主導(dǎo)地位�；�于上皮細胞中的表達信號，子宮內(nèi)膜腺癌被分為了三種模式，子宮內(nèi)膜腺癌的晚期階段（III 期和 IV 期）具有更強的SOX9+LGR5+信號。
       總之，本研究分析表明功能失調(diào)的上皮細胞是子宮內(nèi)膜疾病的主要驅(qū)動因素。 通過分析兩個 SOX9 細胞群體的轉(zhuǎn)錄組，我們得到在子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜異位癥中占主導(dǎo)地位的特定細胞信號。

4、微環(huán)境對上皮細胞分化的影響

       通過分析整個月經(jīng)周期中調(diào)節(jié)上皮細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因的表達，結(jié)果表明 NOTCH 和 WNT 通路在調(diào)節(jié)分泌和纖毛細胞譜系分化中的不同作用。參與 WNT 通路的基因FOXJ1和LGR5在腔表面高度表達，而NOTCH2在功能層的腺體中富集。研究者進一步使用免疫組織化學(xué)結(jié)合 smFISH 實驗對結(jié)果進行了驗證。
       研究者開發(fā)了 CellPhoneDB v.3.0，該升級版本在映射配體-受體對時會考慮空間細胞共定位。根據(jù)單細胞和空間的聯(lián)合分析確定了三個以上皮細胞為中心的子宮內(nèi)膜微環(huán)境，在每個微環(huán)境上運行 CellPhoneDB，發(fā)現(xiàn)顯著的上皮-基質(zhì)相互作用。此外，蛻膜基質(zhì)細胞表達的DKK1（WNT通路的抑制劑）顯著高于非蛻膜基質(zhì)細胞，在空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)中也發(fā)現(xiàn)了圍繞分泌內(nèi)皮腺體的DKK1的表達�？傊�，這些發(fā)現(xiàn)表明 WNT 信號是在分泌細胞譜系中被抑制，NOTCH信號將占主導(dǎo)地位。


5、子宮內(nèi)膜類器官對卵巢激素的反應(yīng)

       研究者進一步通過在單細胞水平上分析子宮內(nèi)膜類器官來檢測 WNT 和 NOTCH 信號通路在體外對子宮內(nèi)膜上皮細胞的潛在作用。通過單細胞實驗數(shù)據(jù)證實類器官對激素的反應(yīng)與體內(nèi)相似，卵巢激素在體內(nèi)和體外都激活了相似的途徑。為了測試 WNT 和 NOTCH 通路在纖毛和分泌細胞分化中的作用，研究者在 NOTCH 或 WNT 抑制劑存在的情況下培養(yǎng)類器官，使用組織學(xué)和單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)來分析表明，在 NOTCH 抑制劑存在下，有較高比例的纖毛細胞和較低比例的分泌細胞。當(dāng) WNT 被抑制時纖毛細胞幾乎不存在，分泌細胞的比例增加。

總結(jié)

       本文生成了人類子宮的單細胞和空間細胞圖譜以及子宮內(nèi)膜類器官，這些將提高對常見疾�。ò�括不孕癥、子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜癌）中發(fā)生的分子和細胞異常的理解。本文剖析了決定管腔和腺體微環(huán)境中上皮細胞的信號通路，揭示了在體內(nèi)和體外調(diào)節(jié)分泌和纖毛細胞分化的途徑。WNT 或 NOTCH 通路的體外下調(diào)分別增加了分泌和纖毛細胞的分化效率。研究人員利用這個細胞圖譜來解讀了來自子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜病變的群體數(shù)據(jù)，闡明了這些疾病中占主導(dǎo)地位的細胞類型。這些結(jié)論為未來開發(fā)包括子宮內(nèi)膜異位癥和子宮內(nèi)膜癌等常見疾病的治療方法提供了一個理論支持。


參考文獻：
Garcia-Alonso, Luz, et al. “Mapping the temporal and spatial dynamics of the human endometrium in vivo and invitro.” Nature Genetics 53.12 (2021): 1698-1711.

     
附：子宮內(nèi)膜組織解離原理

      在組織樣本離體后24h內(nèi)進行組織解離 ，進行兩步酶消化處理；首先用膠原酶處理子宮內(nèi)膜組織以回收基質(zhì)部分，隨后經(jīng)過濾把保留在 100 μm 過濾器上的組織片用胰蛋白酶處理以富集上皮部分。

詳細實驗步驟如下：
一. 用膠原酶解離子宮內(nèi)膜
1. 配制混合膠原酶液。
2. 刮掉組織上殘存的血管。注意：如果供體被灌注，我們可以跳過這一步。
3. 用 PBS 清洗組織{可選}。
4. 將濕紙巾放在培養(yǎng)皿下，取 2 把手術(shù)刀，將組織大致切碎。
5. 將切碎的組織轉(zhuǎn)移到含有膠原酶混合物的 50 mL裂解管中（~ 3 毫升/組織，取決于組織的大�。�。
6. 擰緊蓋子，然后用封口膜密封。
7. 在 37 °C 下孵育45min ，孵育中要搖勻組織。
8. 用 20 mL 10%的RPMI 重懸組織。
9. 使用小孔過濾器 (100um) 過濾樣品——不要丟棄濾膜上殘留的組織，殘留的組織將用于“子宮內(nèi)膜-胰蛋白酶”方案。
10. 已過濾得到的樣品以 450 g 離心5min。
11. 用 10 mL 的 PBS 洗滌兩次。
12. 用 1 mL RPMI 10% 重懸細胞，計數(shù)細胞并分選細胞群（請參閱流式細胞術(shù)和分選的“細胞”染色方案)。


二、接下來對濾膜上殘存的組織進行-胰蛋白酶處理
1. 配制胰蛋白酶處理混合液。
2 .按照“用膠原酶解離子宮內(nèi)膜”方案的第 9步，將組織碎片保留在細胞過濾器上。通過將過濾器倒置到新的 50 mL 管中并用 1 mL 移液器加入 45 mL PBS溶液 來收集保留在過濾器上的碎片。
3.與上一步膠原酶處理后得到的樣品混合在一起后，以 450 g 離心5min，棄去上清液。
4. 用 10 mL 0.25% 的胰蛋白酶/EDTA溶液重懸碎片，并在 37 °C 下?lián)u動孵育20min 。
5. 加入 20 mL含 10% FBS 的 RPMI。
6. 緩慢且小心地將樣品通過 100 μM 的濾膜（此時是非常稠密的液體），丟棄濾膜上殘留的組織。
7. 在 4℃下，以 500 rcf 離心5min，棄去上清液。
8 .{可選} 用 5 mL的 RLB 混合物重懸樣品并孵育 10min。
 *RLB溶液的制備：用水稀釋 10x RLB 原液 ；RBC 裂解后，加入 10 mL 1 的 PBS 并以 500 rcf 離心 5min；
9. 用 1 mL PBS溶液 重懸細胞。
10. 在 4℃下，以 500 rcf 離心5min，棄去上清液。
11. 用 250 μL的 PBS 重懸細胞（最終體積取決于細胞數(shù)）
12. 使用細胞過濾器過濾細胞。
13. 使用臺盼藍和血細胞計數(shù)器計數(shù)活細胞。