01 你聽說過類器官嗎？
我們?cè)趪�外生化類科幻大片中�?jīng)�？吹饺嗽烊�，在制作改造人之前他們會(huì)做一些人造器官，所有我們經(jīng)常會(huì)看到一些心臟或者其他器官在培養(yǎng)液中的畫面，當(dāng)然這些都是人們的腦洞所想象出的科幻電影。但是我們目前的科研水平已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了3D類器官的構(gòu)建。2009年，荷蘭Hubrecht研究所的 Hans Clevers 團(tuán)隊(duì)成功的將成體干細(xì)胞培養(yǎng)成為小腸的隱窩和絨毛結(jié)構(gòu)，開啟了類器官發(fā)展的新篇章。下面小愛繼續(xù)給您介紹什么是類器官？

 

Hans Clevers-小腸干細(xì)胞marker Lgr5發(fā)現(xiàn)者

02 什么是類器官？
類器官顧名思義就是一種類似器官但又不是器官的3D細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)。通過在體外培養(yǎng)胚胎或成體干細(xì)胞，讓其增殖分化形成具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能的類似于器官的3D細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)。這些細(xì)胞結(jié)構(gòu)雖然不是真正意義上的人類器官，但能在某些結(jié)構(gòu)和功能上模擬真實(shí)器官，因此，把這些微型人造器官命名為：類器官（organoids）。

類器官明場圖及組化鑒定

03 類器官的發(fā)展史
類器官的研究熱點(diǎn)主要是病人來源的類器官 (Patient-Derived Organoids, PDOs)，因?yàn)橥ǔＳ糜谀[瘤患者的疾病建模、研究與藥物篩選，常常被稱為腫瘤類器官。腫瘤類器官的發(fā)展開始于2013年，自此之后呈逐年上升趨勢。腫瘤類器官是指將患者活檢、穿刺或手術(shù)切除組織在基質(zhì)膠中培養(yǎng)數(shù)周得到的類器官。腫瘤類器官在高度保持源腫瘤的異質(zhì)性和患者之間的異質(zhì)性的同時(shí)，類器官個(gè)體間形態(tài)、尺度保持基本均一，為腫瘤發(fā)病機(jī)理研究、藥物篩選、個(gè)性化精準(zhǔn)醫(yī)療、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域提供了快速、優(yōu)良的技術(shù)平臺(tái)。

類器官的發(fā)展成果，主要集中在近十余年。
•  2007年，Hans Clevers 的實(shí)驗(yàn)室通過 lineage tracing 驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小腸和結(jié)腸的干細(xì)胞為 Lgr5+細(xì)胞。
•  2009年，Hans Clevers實(shí)驗(yàn)室使用單個(gè)鼠LGR5+腸干細(xì)胞在體外自組織成為具有腸隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)的腸類器官。
•  2011年，由人多能干細(xì)胞和原代成體干細(xì)胞發(fā)育而來的腸類器官被成功制作。同年，由鼠胚胎干細(xì)胞培育而來的視網(wǎng)膜類器官被首次成功培育。
•  2012年，由人多能干細(xì)胞發(fā)育而來的視網(wǎng)膜類器官成功培育。
•  2013年，由人多能干細(xì)胞發(fā)育而來的腦類器官被成功培育。肝、腎、胰類器官被成功培育。
•  2014年，前列腺、肺類器官被成功培育。
•  2015年，乳腺、輸卵管、海馬體類器官被成功培育。
•  2020年，蛇毒液腺類器官被成功培育。

04 類器官的分類
目前類器官分為兩類：組織來源類器官和多能干細(xì)胞來源類器官。下面是已經(jīng)構(gòu)建成功的類器官種類

05為什么要“類器官”
相比傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)模型，類器官代表著一種能夠概括整個(gè)生物體生理過程的創(chuàng)新技術(shù)，具有更接近生理細(xì)胞組成和行為、更穩(wěn)定的基因組、更適合于生物轉(zhuǎn)染和高通量篩選等優(yōu)勢。而與動(dòng)物模型相比，類器官模型的操作更簡單，還能用于研究疾病發(fā)生和發(fā)展等機(jī)理。因而在器官發(fā)育、精準(zhǔn)醫(yī)療、再生醫(yī)學(xué)、藥物篩選、基因編輯、疾病建模等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用前景。

類器官 VS 組織樣本 VS 動(dòng)物模型

06 類器官相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)流程
類器官的培養(yǎng)可以利用體細(xì)胞、成體干細(xì)胞（包括祖細(xì)胞）或多能干細(xì)胞。類器官培養(yǎng)系統(tǒng)主要包括基質(zhì)膠、維持類器官生態(tài)所需因子和分化所需因子這幾個(gè)主要元素�；�質(zhì)膠中含有膠原、巢蛋白和纖連蛋白等等，為類器官形成三維空間結(jié)構(gòu)提供基質(zhì)。維持類器官生態(tài)因子主要目的為促進(jìn)細(xì)胞的增殖和抑制細(xì)胞凋亡等。

下面以小腸組織為例
實(shí)驗(yàn)材料
1、 儀器設(shè)備
CO2 培養(yǎng)箱、雙人單面超凈臺(tái)、倒置顯微鏡、臺(tái)式冷凍離心機(jī)、水浴鍋、水浴搖床，醫(yī)用冰箱、-80°冰箱、移液器（一套）、眼科剪、眼科鑷。

2、 試劑耗材
腸癌類器官培養(yǎng)試劑盒(abs9445)，基質(zhì)膠(abs9495)，60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，100μm濾篩，15ml離心管，1.5ml EP管若干，4度冰盒，眼科剪刀，眼科鑷，

試劑盒組成

組分	名稱	規(guī)格	保存
A組分	結(jié)直腸癌類器官緩沖液	100ml	4℃
B組分	結(jié)直腸癌類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基	100ml	4℃
C組分	organo原代酶解液	25ml	4℃
D組分	organo消化液	25ml	4℃
E組分	organo原代酶終止液	100ml	4℃
F組分	組織保存液	100ml	4℃
G組分	organo凍存液	25ml	4℃

實(shí)驗(yàn)方法
1、原代
（1）將組織放入含有特殊組織保存液F的組織取樣瓶中放入冰盒4℃，拍照并登記信息。
（2）取樣瓶消毒，組織放入培養(yǎng)皿，結(jié)直腸癌類器官緩沖液A清洗三次后于培養(yǎng)皿中剪碎，大約1mm3的組織塊。
（3）癌組織用organo原代酶解液C消化，37℃震蕩消化10-20 min，（消化過程中隨時(shí)觀察消化情況）加入三倍體積organo原代酶終止液E終止消化。
（4）使用100μm孔徑的篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，取少量濾液在鏡下進(jìn)行觀察，可以看到明顯的組織塊，將濾液收集后于300g富集離心3-5min后移去上清，重新重懸離心。
（5）去除上清，使用適量基質(zhì)膠（abs9495）進(jìn)行重懸(24孔板為例，每孔30ul）之后進(jìn)行鋪板（4℃下操作）拍照追蹤定位。
（6）將鋪好的板子放入37℃培養(yǎng)箱中10-15min成膠，添加培養(yǎng)基B（恢復(fù)室溫）進(jìn)行培養(yǎng)。

2、類器官傳代培養(yǎng)
（1）移液器吸去培養(yǎng)基，添加4℃類器官緩沖液A放置一分鐘。
（2）移液槍輕柔吹打基質(zhì)膠，收集在15ml離心管中，4℃靜置5min。（3）離心5min棄去液體，添加適量類器官緩沖液A重懸移入1.5ml離心管，300g離心5min棄去液體或（添加適量消化液D作用90-120S終止，離心5min棄去混合液）。
（4）類器官收集后，添加適量類器官凍存液G，按500個(gè)/ml密度凍存（或進(jìn)行步驟5）。
（5）類器官收集后，基質(zhì)膠重懸，每孔30μl基質(zhì)膠鋪在24孔板中，放置培養(yǎng)箱中10min添加500μl結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基B。

3、凍存
（1）在傳代第二步，添加凍存液
（2）500個(gè)/ml 密度凍存，溫度梯度降溫-80度，保存

4、類器官復(fù)蘇
（1）取10ml于15ml離心管中。
（2）從液氮罐中取出凍存的腫瘤類器官細(xì)胞，快速置于 37℃水浴鍋中融解。
（3）水浴融解過程中，需輕輕搖動(dòng)冷凍管，以確保凍存液在 1-2 分鐘內(nèi)完全融解。
（4）將溶解后的類器官細(xì)胞快速轉(zhuǎn)移至15ml 無菌離心管，使用移液管輕輕吹打3次，300g 離心 3分鐘，然后除去上清液并收集類器官細(xì)胞沉淀。添加適量結(jié)直腸癌類器官緩沖液A重懸移入1.5ml離心管300g離心5min。
（5）基質(zhì)膠重懸，每孔20μl基質(zhì)膠鋪在24控板中，放置培養(yǎng)箱中10min添加500μl結(jié)直腸癌類器官培養(yǎng)基B。

5、鑒定
類器官的鑒定主要有形態(tài)學(xué)觀察、基因分析、標(biāo)志物檢測、組織學(xué)染色這幾種手段。

6、藥敏
（1）藥物準(zhǔn)備階段（藥物種類、濃度）。
（2）在傳代基礎(chǔ)上接種到96孔板上，加藥，牌照。在藥物活性第5天檢測細(xì)胞活性。

類器官藥敏檢測全流程

 

類器官	細(xì)胞因子	小分子化合物
小腸/結(jié)腸類器官	EGF、Noggin、R-Spondin 1、Wnt-3a	A 83-01、Gastrin、Nicotinamide、SB 202190、Y 27632
胃類器官	FGF-10、 EGF、Noggin、R-Spondin 1、Wnt-3a	A 83-01、Gastrin、Nicotinamide、SB 202190、Y 27632
肝臟類器官	BMP-4、EGF、FGF-basic、FGF-10、HGF、Noggin、Wnt-3a	A 83-01、DAPT、Forskolin、Gastrin、Nicotinamide、Y 27632、Prostaglandin E2
肺類器官	Activin A、FGF-basic、FGF-4、Noggin	CHIR 99021、SB 431542
前列腺類器官	EGF、Activin A、FGF-basic、FGF-10、Noggin、R-Spondin 1、Wnt-10b	A 83-01、SB 202190、Y 27632、Prostaglandin E2、Nicotinamide、Testosterone
胰腺類器官	FGF-10、 EGF、Noggin、R-Spondin 1、Wnt-3a	A 83-01、Nicotinamide、Gastrin
腎類器官	BMP-2、BMP-4、BMP-7、FGF-basic、FGF-9	CHIR 99021、Retinoic Acid
乳腺類器官	Heregulinβ-1、R-Spondin 1、R-Spondin 2、Noggin、EGF、 FGF-basic、FGF-10、Wnt-3a	Prolactin、Y 27632
腦類器官	FGF-basic、Noggin、DKK-1、 EGF、BDNF、GDNF	MK-2206、GDC-0068、Dorsomorphin、Y 27632
視網(wǎng)膜類器官	SHH、Wnt-3a	CHIR 99021、Y 27632
內(nèi)耳類器官	BMP-4、 FGF-basic	A 83-01、SB 431542

07 類器官研究相關(guān)技術(shù)及解決方案
1 基因編輯技術(shù)在類器官研究中的應(yīng)用
CRISPR-Cas9是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御，可用來對(duì)抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，則是對(duì)靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)也是用于基因編輯中前沿的方法。

2020年3月2日，荷蘭胡布勒支研究組在Nature Cell Biology雜志上發(fā)表文章Fast and efficient generation of knock-in human organoids using homology-independent CRISPR–Cas9 precision genome editing，利用非同源依賴的CRISR-Cas9技術(shù)快速高效地對(duì)人源類器官進(jìn)行基因敲入，作者們將該技術(shù)命名為CRISPR–HOT(CRISPR-Cas9-mediated homology-independent organoid transgenesis)，為人源類器官的內(nèi)源基因敲入提供了重要的工具平臺(tái)。

文章通過使用CRISPR-HOT的遺傳工具來研究肝細(xì)胞如何分裂和具有太多DNA的異常肝細(xì)胞如何出現(xiàn)。通過讓癌基因TP53失去功能，他們發(fā)現(xiàn)異常肝細(xì)胞的非結(jié)構(gòu)化分裂更為頻繁，這可能有助于促進(jìn)癌癥產(chǎn)生。隨后使用CRISPR-HOT將熒光標(biāo)記插入人類類器官的DNA中，從而使得這些熒光標(biāo)記附著在他們想要研究的特定基因上，建立了人肝臟導(dǎo)管類器官的報(bào)告基因品系，可以利用活體成像、切片染色等方式可視化觀察內(nèi)源表達(dá)的基因表達(dá)模式以及動(dòng)態(tài)變化過程。

2 類器官在研究疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制中應(yīng)用-基因編輯
研究背景：在印戒癌(SRCC)中常見E-鈣粘蛋白的表達(dá)缺失，CDH1基因編碼E-鈣粘蛋白，是鈣依賴性細(xì)胞粘附蛋白，屬于鈣粘蛋白家族成員，CDH1基因參與調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、遷移和上皮細(xì)胞增殖，其功能缺失導(dǎo)致細(xì)胞更容易侵襲與轉(zhuǎn)移，該基因的突變與胃癌密切相關(guān)。因此，E-鈣粘蛋白表達(dá)的缺失可能會(huì)增加患胃癌的概率。

2022年6月，日本科研團(tuán)隊(duì)在Gastric Cancer上發(fā)表了Potential therapeutic targets discovery by transcriptome analysis of an in vitro human gastric signet ring carcinoma model，利用基本編輯技術(shù)，敲出了正常胃癌類器官的CDH1基本，，構(gòu)建了E-鈣粘蛋白的胃癌類器官模型。

通過RNA-seq測序，研究發(fā)現(xiàn)敲除后的腫瘤類器官與SRCC的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞活力類似，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，CDH 1 KO hGO細(xì)胞中matrix metalloproteinase (MMP）基因上調(diào)，MMP為水解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的酶類，包括基質(zhì)中以及整合于質(zhì)膜中的各種膠原酶和彈性蛋白酶等。然后科學(xué)家們對(duì)95例臨床胃癌組織樣本進(jìn)行免疫熒光驗(yàn)證，結(jié)果顯示，MMP-3 的確在臨床樣本中高表達(dá)。此外發(fā)現(xiàn)，CXCR4從細(xì)胞核易位細(xì)胞膜上，加入CXCR4的配體CXCL12后，基因敲除的類器官生長期變長，在臨床SRCC患者中纖維細(xì)胞分泌高表達(dá)CXCL12。從而得出結(jié)論MMP和CXCL12/CXCR4有望成為E -cadherin缺陷性SRCC的新治療靶點(diǎn)。

3 單細(xì)胞測序中類器官技術(shù)應(yīng)用
單細(xì)胞測序技術(shù)也是近年來受到青睞的明星技術(shù)，分別在2018年和2019年被 Science 期刊評(píng)為年度十大技術(shù)，被 Nature methods 評(píng)為年度方法。高通量單細(xì)胞測序技術(shù)通過對(duì)每個(gè)細(xì)胞遺傳物質(zhì)的分析，在單細(xì)胞分辨率下研究細(xì)胞的發(fā)育、分化，成為探索組織發(fā)育、腫瘤異質(zhì)性等生物問題的重要方法。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序與類器官結(jié)合，pubmed關(guān)鍵詞搜索已經(jīng)達(dá)到251篇，類器官技術(shù)極大推動(dòng)了器官發(fā)育、腫瘤研究、藥物篩選、臨床研究等多個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展。

2021年11月，德國科學(xué)家團(tuán)隊(duì)在 nature communication上發(fā)表了Single-cell analysis of patient-derived PDAC organoids reveals cell state heterogeneityand a conserved，文章構(gòu)建了18個(gè)原發(fā)性胰腺導(dǎo)管腺癌和6個(gè)胰腺導(dǎo)管腺癌肝轉(zhuǎn)移腫瘤類器官，通過10X genomic單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序比較分析腫瘤類器官和原發(fā)性 PDAC，鑒定共有細(xì)胞亞群，包括循環(huán)祖細(xì)胞和分化的分泌細(xì)胞亞群。“classical”細(xì)胞亞群為胰腺導(dǎo)管腺癌分化發(fā)育的最終形態(tài)。在基于活體成像的藥物篩選實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)“classical”亞群細(xì)胞基因表達(dá)，則對(duì)藥物反應(yīng)敏感。

PDAC離體腫瘤樣本很難獲取，且惡性細(xì)胞含量較低。通過建立 PDAC單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜，顯示與原組織相似，證明了 PDAC 類器官可作為腫瘤異質(zhì)性體外研究的臨床相關(guān)模型，可為患者臨床治療預(yù)后判斷提供依據(jù)。

08類器官的未來發(fā)展
1 類器官未來發(fā)展方向-血管生成
目前大多類器官本身并不具備血管化的結(jié)構(gòu)。隨著類器官體積的增長，類器官受限于氧氣的缺失以及代謝廢物的增加，可能導(dǎo)致的組織壞死。已有研究構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞微環(huán)境的腫瘤類器官，將類器官腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel上共同培養(yǎng)，生成血管結(jié)構(gòu)以期解決類器官血管化缺失的問題

2 類器官未來發(fā)展方向-共培養(yǎng)
2019年Nature Protocol 期刊發(fā)表了腫瘤類器官和免疫細(xì)胞共同培養(yǎng)的相關(guān)protocol，可以體現(xiàn)和模擬出腫瘤微環(huán)境的部分特征。以上皮類器官和免疫細(xì)胞共培養(yǎng)模型為例，可通過在培養(yǎng)基中添加活化的免疫細(xì)胞、在組織消化成單細(xì)胞后和免疫細(xì)胞共同生長、添加ECM中的重組細(xì)胞因子等方法重塑類器官和免疫細(xì)胞的相互作用。

3 類器官未來發(fā)展方向-標(biāo)準(zhǔn)化
標(biāo)準(zhǔn)的形成，是在中國干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)及陳曄光院士的支持和推動(dòng)下，由陳曄光院士團(tuán)隊(duì)聯(lián)合國內(nèi)幾十家單位制定。編者聯(lián)合學(xué)術(shù)界、產(chǎn)業(yè)界專家對(duì)腸癌類器官的培養(yǎng)，鑒定和質(zhì)控等一系列過程進(jìn)行了探討，經(jīng)過大量數(shù)據(jù)研究及充分研討，最終形成國內(nèi)首個(gè)人腸癌類器官標(biāo)準(zhǔn)，為類器官技術(shù)的臨床研究和臨床實(shí)踐提供了規(guī)范和指導(dǎo)。

該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了人腸癌類器官及人腸道類器官的定義、倫理要求、技術(shù)要求和檢測方法，為患者來源的人腸癌類器官的制備和檢測提供了技術(shù)支持。該標(biāo)準(zhǔn)的制定獲得了類器官及標(biāo)準(zhǔn)領(lǐng)域中外專家廣泛的關(guān)注與高度評(píng)價(jià)。