逆轉(zhuǎn)錄酶與Taq DNA聚合酶的特點(diǎn)及應(yīng)用介紹
酶是一類極為重要的生物催化劑，具有催化高效性和反應(yīng)特異性。絕大多數(shù)生化反應(yīng)均需要酶的參與，核酸檢測也不例外。不同類型的分子酶在核酸檢測的不同實(shí)驗(yàn)階段發(fā)揮了重要的作用。
一、逆轉(zhuǎn)錄酶，分享該酶的特點(diǎn)和應(yīng)用
逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）是以RNA為模板合成DNA的過程，即RNA指導(dǎo)下的DNA合成。此過程中，核酸合成與轉(zhuǎn)錄（DNA到RNA）過程與遺傳信息的流動(dòng)方向（RNA到DNA）相反，故稱為逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄過程由逆轉(zhuǎn)錄酶催化。
大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄酶都具有以下幾種活性。
①DNA聚合酶活性；
以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。逆轉(zhuǎn)錄酶的合成能力決定了產(chǎn)生的cDNA鏈的長短，一些基因工程改造的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶在單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)中可以結(jié)合多達(dá)1,500個(gè)核苷酸，結(jié)合能力大概是野生型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶的65倍。
逆轉(zhuǎn)錄酶中不具有3'→5'外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯(cuò)率比較高，基于MMLV的逆轉(zhuǎn)錄酶錯(cuò)誤率在合成15,000到27,000個(gè)核苷酸中有一個(gè)錯(cuò)誤核苷酸。
②RNase H活性；
由逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNase H從RNA 5'端水解掉RNA分子。但是RNase H活性的存在可能降低逆轉(zhuǎn)錄效率，所以工程化的逆轉(zhuǎn)錄酶，通常會(huì)降低甚至消除RNase H活性，以提高cDNA合成效率。
③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；
以逆轉(zhuǎn)錄合成的第一條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。
除此之外，工程化的逆轉(zhuǎn)錄酶都具備一定的溫度耐受性，有助于使具有堅(jiān)固二級結(jié)構(gòu)和/或高GC含量的RNA變性，使得逆轉(zhuǎn)錄酶能夠讀取序列，增加cDNA合成長度，提高合成效率。
GenFQ III Reverse Transcriptase是經(jīng)過基因工程改造的新一代逆轉(zhuǎn)錄酶，大幅提高了熱穩(wěn)定性，無RNase H活性。可以在42-55℃(高溫有利于打開RNA二級結(jié)構(gòu))條件下合成第一鏈cDNA，最佳反應(yīng)溫度為50℃。具有靈敏度高、特異性高、聚合能力強(qiáng)、 熱穩(wěn)定性強(qiáng)和半衰期長特點(diǎn)。該酶增強(qiáng)了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉(zhuǎn)錄。
合成效率為95.1%，證明cDNA的合成效率較高，而且RNA梯度稀釋線性關(guān)系良好。
二、Taq DNA聚合酶
PCR技術(shù)改變了現(xiàn)代分子生物學(xué)，而Taq DNA聚合酶改變了PCR。Taq DNA聚合酶是一種從Thermus aquaticm分離出的耐熱型DNA 聚合酶，主要應(yīng)用在直接PCR、等位基因檢測、Sanger測序、TA克隆等領(lǐng)域。
Taq DNA聚合酶改具有良好的耐熱型，最適催化溫度在75-80℃，95℃半小時(shí)后仍保留50%以上的活性。Taq DNA聚合酶是少數(shù)具有5'-3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶之一。能夠切除5’端放射性標(biāo)記的DNA探針，通過放射性信號的變化，實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的特異性檢測。
但是普通的Taq DNA聚合酶22°C時(shí)仍然有很低速的核酸合成，大約為0.25核苷/秒/酶分子，也就是說引物還沒有正常配對，而酶已經(jīng)催化了合成，會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。
基于Taq DNA聚合酶開發(fā)的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶，利用酶的修飾物在常溫下抑制DNA聚合酶的活性，加熱到變性溫度時(shí)修飾物失活，酶活得以釋放，從而使PCR反應(yīng)正常進(jìn)行，解決了PCR反應(yīng)中引物二聚體產(chǎn)生或錯(cuò)配引起的非特異性擴(kuò)增等問題，提高了PCR反應(yīng)的特異性。
濟(jì)凡生物Flash Robust HotStart DNA Polymerase （A210）是基于野生型Taq DNA聚合酶定向化改造得到的新型熱啟動(dòng)酶，采用雙抗體封閉，有效防止錯(cuò)配或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，有效抑制探針降解產(chǎn)生的熒光信號下降，具有超高的擴(kuò)增效率、較高的擴(kuò)增靈敏度（可達(dá)個(gè)位拷貝數(shù)擴(kuò)增）和特異性，具有較強(qiáng)的血液及PCR抑制劑耐受性。適用于各種基于Taq DNA Polymerase的熱啟動(dòng)PCR、qPCR反應(yīng)，可用于從復(fù)雜模板(基因組和cDNA)中擴(kuò)增低拷貝基因，可用于血液直擴(kuò)等直接擴(kuò)增PCR。
以非瘟質(zhì)粒為模板，進(jìn)行9個(gè)10倍梯度稀釋，第9個(gè)稀釋梯度中質(zhì)�？截悢�(shù)濃度約為6 copies/2μl。對各稀釋梯度進(jìn)行檢測，每孔模板使用量為2μl�？梢钥吹�，A210在寬廣的模板量區(qū)間內(nèi)具有優(yōu)秀的線性關(guān)系，可以輕松檢測出個(gè)位數(shù)拷貝的待測模板。
一、逆轉(zhuǎn)錄酶，分享該酶的特點(diǎn)和應(yīng)用
逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription）是以RNA為模板合成DNA的過程，即RNA指導(dǎo)下的DNA合成。此過程中，核酸合成與轉(zhuǎn)錄（DNA到RNA）過程與遺傳信息的流動(dòng)方向（RNA到DNA）相反，故稱為逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄過程由逆轉(zhuǎn)錄酶催化。
大多數(shù)逆轉(zhuǎn)錄酶都具有以下幾種活性。
①DNA聚合酶活性；
以RNA為模板，催化dNTP聚合成DNA的過程。逆轉(zhuǎn)錄酶的合成能力決定了產(chǎn)生的cDNA鏈的長短，一些基因工程改造的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶在單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)中可以結(jié)合多達(dá)1,500個(gè)核苷酸，結(jié)合能力大概是野生型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶的65倍。
逆轉(zhuǎn)錄酶中不具有3'→5'外切酶活性，因此沒有校正功能，所以由逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成的DNA出錯(cuò)率比較高，基于MMLV的逆轉(zhuǎn)錄酶錯(cuò)誤率在合成15,000到27,000個(gè)核苷酸中有一個(gè)錯(cuò)誤核苷酸。
②RNase H活性；
由逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成的cDNA與模板RNA形成的雜交分子，將由RNase H從RNA 5'端水解掉RNA分子。但是RNase H活性的存在可能降低逆轉(zhuǎn)錄效率，所以工程化的逆轉(zhuǎn)錄酶，通常會(huì)降低甚至消除RNase H活性，以提高cDNA合成效率。
③DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；
以逆轉(zhuǎn)錄合成的第一條DNA單鏈為模板，以dNTP為底物，再合成第二條DNA分子。
除此之外，工程化的逆轉(zhuǎn)錄酶都具備一定的溫度耐受性，有助于使具有堅(jiān)固二級結(jié)構(gòu)和/或高GC含量的RNA變性，使得逆轉(zhuǎn)錄酶能夠讀取序列，增加cDNA合成長度，提高合成效率。
GenFQ III Reverse Transcriptase是經(jīng)過基因工程改造的新一代逆轉(zhuǎn)錄酶，大幅提高了熱穩(wěn)定性，無RNase H活性。可以在42-55℃(高溫有利于打開RNA二級結(jié)構(gòu))條件下合成第一鏈cDNA，最佳反應(yīng)溫度為50℃。具有靈敏度高、特異性高、聚合能力強(qiáng)、 熱穩(wěn)定性強(qiáng)和半衰期長特點(diǎn)。該酶增強(qiáng)了與模板的親和力，適合少量模板以及低拷貝基因的逆轉(zhuǎn)錄。
合成效率為95.1%，證明cDNA的合成效率較高，而且RNA梯度稀釋線性關(guān)系良好。
熱穩(wěn)定能力強(qiáng)，熱穩(wěn)定7d對反轉(zhuǎn)錄效率無影響
二、Taq DNA聚合酶
PCR技術(shù)改變了現(xiàn)代分子生物學(xué)，而Taq DNA聚合酶改變了PCR。Taq DNA聚合酶是一種從Thermus aquaticm分離出的耐熱型DNA 聚合酶，主要應(yīng)用在直接PCR、等位基因檢測、Sanger測序、TA克隆等領(lǐng)域。
Taq DNA聚合酶改具有良好的耐熱型，最適催化溫度在75-80℃，95℃半小時(shí)后仍保留50%以上的活性。Taq DNA聚合酶是少數(shù)具有5'-3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶之一。能夠切除5’端放射性標(biāo)記的DNA探針，通過放射性信號的變化，實(shí)現(xiàn)PCR產(chǎn)物的特異性檢測。
但是普通的Taq DNA聚合酶22°C時(shí)仍然有很低速的核酸合成，大約為0.25核苷/秒/酶分子，也就是說引物還沒有正常配對，而酶已經(jīng)催化了合成，會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。
基于Taq DNA聚合酶開發(fā)的熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶，利用酶的修飾物在常溫下抑制DNA聚合酶的活性，加熱到變性溫度時(shí)修飾物失活，酶活得以釋放，從而使PCR反應(yīng)正常進(jìn)行，解決了PCR反應(yīng)中引物二聚體產(chǎn)生或錯(cuò)配引起的非特異性擴(kuò)增等問題，提高了PCR反應(yīng)的特異性。
濟(jì)凡生物Flash Robust HotStart DNA Polymerase （A210）是基于野生型Taq DNA聚合酶定向化改造得到的新型熱啟動(dòng)酶，采用雙抗體封閉，有效防止錯(cuò)配或引物二聚體引起的非特異性擴(kuò)增，有效抑制探針降解產(chǎn)生的熒光信號下降，具有超高的擴(kuò)增效率、較高的擴(kuò)增靈敏度（可達(dá)個(gè)位拷貝數(shù)擴(kuò)增）和特異性，具有較強(qiáng)的血液及PCR抑制劑耐受性。適用于各種基于Taq DNA Polymerase的熱啟動(dòng)PCR、qPCR反應(yīng)，可用于從復(fù)雜模板(基因組和cDNA)中擴(kuò)增低拷貝基因，可用于血液直擴(kuò)等直接擴(kuò)增PCR。
以非瘟質(zhì)粒為模板，進(jìn)行9個(gè)10倍梯度稀釋，第9個(gè)稀釋梯度中質(zhì)�？截悢�(shù)濃度約為6 copies/2μl。對各稀釋梯度進(jìn)行檢測，每孔模板使用量為2μl�？梢钥吹�，A210在寬廣的模板量區(qū)間內(nèi)具有優(yōu)秀的線性關(guān)系，可以輕松檢測出個(gè)位數(shù)拷貝的待測模板。
標(biāo)簽：
逆轉(zhuǎn)錄酶
Taq DNA聚合酶
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