文章題目：Subtype-Specific Prevalence of Hepatitis C Virus NS5A Resistance Associated Substitutions in Mainland China
作者單位：上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院、金域醫(yī)學檢驗中心
發(fā)表刊物：Frontiers in Microbiology （if 4.259，2019）
接收時間：2019年3月1日

 

丙型肝炎防治指南（2019年版）提到：慢性HCV感染者的抗病毒治療已經進入直接抗病毒藥物（DAA）的藥物時代，泛基因型方案在已知主要基因型和主要基因亞型的HCV感染者中達到90%以上的持續(xù)病毒學應答（SVR），而對于未獲得SVR的基因亞型和耐藥相關替代突變（Resistance associated substitution，RAS）的感染者，還需要規(guī)范的臨床試驗和精準耐藥檢測來確定合適的治療方案。

RASs可能引起HCV DAAs抗病毒效能下降，導致治療失敗。有報道稱NS5A RASs可能影響百立澤（達拉他韋）+速維普（阿舒瑞韋）、夏凡寧（雷迪帕韋+索磷布韋）等方案的療效等。NS5A RASs在不同地理區(qū)域的不同基因型之間檢出頻率不同，基于大部分RASs的研究集中在1型，這篇文章是分享NS5A RASs不同HCV亞型在中國的流行情況。

 

材料：

1.廣州金域醫(yī)學檢驗中心收集了2018年1月-6月期間的HCV RNA陽性樣本，從這些做HCV基因分型的樣本中隨機挑選了878例（約1/8）樣本用于NS5A RASs檢測，所有樣本均記錄了性別和年齡。878例樣本來自中國的27個省，亞型主要為1b：489例，2a：203例，3a：60例，3b：78例，6a：48例。
2. 上海瑞金醫(yī)院收集了2015年4月-2017年9月期間185例未接受DAAs治療的HCV 1b樣本，其中有52例在樣本采集時有過干擾素治療的記錄。 

方法：廣州金域的878例樣本使用Sanger測序法分析，上海瑞金的185例樣本使用Sanger測序和NGS兩種方法分析。

 

1.研究人群特征——各亞型在年齡和地域分布不均

年齡分布：與1b和2a相比，3a、3b和6a感染在男性和年輕患者中更常見。

地域分布：2a患者多集中在中國北方，而6a患者多集中在中國東南部。

 

2.NS5A序列的進化分析

3a序列系統(tǒng)上與來自Los Alamos HCV數據庫的35個不同地理來源的參考序列距離較遠。Cluster1序列主要來自中國東部，與2004年從泰國分離出的一毒株(HM042074)有關。cluster2序列與2011年從中國分離到的一個毒株(KC844041)的親緣關系更近，并且表現出混合的地理起源，表明該群集在全國范圍內的流行分布。

3b序列呈散在分布，無地理聚類，cluster3主要來自中國東部，但與廣西柳州分離的部分毒株具有高度的相似性，表明西南地區(qū)的3b型別起源和發(fā)展于此，其他地區(qū)的分離株可能是其后代。

 

3.   NS5A RASs在不同亞型的流行率不同

表2中列出了與臨床最相關的HCV RASs情況：

 

在1b序列中（489例），Y93H約占14.1%，Q24、L28、L31、P32、S38、A92的高度保守。R30和P58的多態(tài)性更高：分別有17.2%和7%的序列含有Q30和S58的替代。

在2a序列中（203例），95.6%的2a受試者發(fā)現了L31M，這表明該氨基酸中的RAS基因頻率較高。Y93位未檢測到RASs。T24S、F28L、K30R、P58S、C92S所占比例分別低至2.5%、2.5%、1.0%、1.5%、3.0%。

3a的序列中（60例），Y93H僅檢測到3.3%，未發(fā)現其他RASs。而在3b（78例）中，檢測到的A30K和L31M突變比例分別為97.4%和98.7%，但未檢測到Y93H。

6a（48例）的Q24K/R、L28F和T58S 的比例分別為18.8%、20.8%、6.3%，但未發(fā)現Y93H。

 

多重RASs可能進一步降低耐藥屏障，文章分析了臨床重要NS5A RASs在亞型間的重疊率。在1b序列中，未發(fā)現28A/M/T/V + 31F/I/M/V的重疊，28A/M/T/V + 93H/N/S(2/489)或31F/I/M/V + 93H/N/S(1/489)頻率較低(圖A)。但在3b序列(75/78)中，A30K + L31M的共存度極高(圖B)。綜上所述，1b序列中的Y93H、2a序列中的L31M、3b序列中的A30K和L31M是導致NS5A RASs在中國流行的主要原因（圖C）。

 

 

4.   1b準種的多樣性

在上表列出的RASs中，Y93H主要與所有亞型的NS5A靶向DAA功效降低有關。Y93H多在1b中發(fā)現(14.1%)，但在其他亞型中很少見到。Y93和Y93H變異患者在年齡和性別上均無統(tǒng)計學差異，但從區(qū)域分布來看，東部地區(qū)的患者Y93H頻率明顯較高(East/non-East, 20.4%/11.0%，p=0.0083)。

為了排除金域的抽樣偏差，瑞金醫(yī)院收集了185例未經DAA治療的HCV 1b樣本，采用Sanger測序和NGS測序兩種方法對其NS5A RASs頻率進行了測試。Y93H/N/S在NGS平臺測到的累積頻率為31.9% (1% cutoff)，而Sanger平臺的頻率為20.5%（與金域數據一致）。但一般認為基線耐藥變異的比例較低(＜15%)不會顯著影響應答，因此文中使用15%作為深度測序的閾值來報告耐藥變異。93H/N/S在1-15%范圍內頻率為12%，在＞15%范圍的頻率為19.5%，跟Sanger平臺的頻率（20.5%）及金域測的頻率（14.3%）較接近。28A/M/T/V和31F/I/M/V在1-15%范圍的頻率分別為7.6%、3.8%，而在＞15%范圍比例非常少。另外，所有樣本核苷準種歸一化香農熵的直方圖表明出現93H/N/S的患者HCV復雜性更高。
 

NS5A RASs的流行率可能會根據不同HCV的基因型/亞型和治療方案而變得多樣化。HCV 1b序列中的Y93H、2a的L31M，3b的A30K和L31M是導致NS5A RASs在中國流行的主要原因。對于未經DAA治療的1b患者，病毒復雜度較高的NS5A 93H發(fā)生率也較高。3b患者對NS5A抑制劑具有天然耐藥性�；�線NS5A RASs的信息可為臨床治療提供指導。由于NS5A抑制劑的重要作用，不同NS5A抑制劑之間的高交叉耐藥，以及NS5A抑制劑耐藥HCV變異的長期存在，因此基線NS5A RASs的患者在選擇DAAs時應謹慎。

本文廣州金域的878例樣本，上海瑞金的185例樣本都使用了Sanger測序，sanger測序法是丙肝分型的金標準方法，可提供被測區(qū)域的全部核苷酸序列/遺傳信息，可以發(fā)現新的基因變異形式，可一次性檢測多個位點，可同時檢測已知和可能的未知耐藥變異位點，假陽性率低等優(yōu)點，是2019版慢性丙型肝炎防治指南推薦方法。

 

作者及單位介紹

【謝青】

現任瑞金醫(yī)院感染科主任、碩士生導師、上海市肝病研究中心專家委員會常務委員、上海市中醫(yī)藥學會感染分會委員、《肝臟》雜志編輯委員會委員。多年來主要從事傳染病學專業(yè)，尤其是病毒性肝炎的臨床和基礎研究。目前作為負責人承擔了兩項國家自然科學基金項目以及一項上海市高校青年科學基金項目。

 

【上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院】

上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院成立于1907年，是三級甲等醫(yī)院。上海瑞金醫(yī)院感染科先后主持了國家“六五”、“七五”及“八五”攻關課題“重癥肝炎發(fā)病機制及治療研究”，取得了許多重大成就。目前瑞金醫(yī)院感染科，除繼續(xù)保持了在重癥肝炎研究領域的領先優(yōu)勢外；在慢性乙型、丙型病毒性肝炎抗病毒治療的優(yōu)化及耐藥檢測、肝移植術后乙丙型病毒性肝炎的復發(fā)、肝細胞損傷分子機制及治療干預等研究方面都居于全國領先地位。

 

【金域醫(yī)學檢驗中心】

廣州金域醫(yī)學檢驗集團股份有限公司是一家以第三方醫(yī)學檢驗及病理診斷業(yè)務為核心的高科技服務企業(yè)，金域醫(yī)學嚴格遵循國際標準，擁有先進的質量管理體系。截至2018年，共獲得包括美國CAP、ISO15189在內的國內外認證認可證書36張，連續(xù)16年領先行業(yè)。檢測結果為全球50多個國家和地區(qū)認可。
 

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