使用說明：
1.Calcein AM/PI檢測工作液的配制:
按照96孔板每孔100μl Calcein AM/PI檢測工作液的體系，參考下表配制適量的Calcein AM/PI檢測工作液，并充分混勻。

注1：為得到比較理想的結(jié)果，可根據(jù)細胞類型和實際染色效果對Calcein AM (1000X)和PI (1000X)在500-2000稀釋倍數(shù)之間進行適當調(diào)整。
注2：配制好的Calcein AM/PI檢測工作液必須一次使用完畢，不能凍存。
注3：也可以用其它合適的溶液，如無血清培養(yǎng)液、HBSS或PBS 稀釋Calcein AM (1000X)。本試劑盒配套提供的檢測緩沖液可在一段時間內(nèi)維持細胞的正常狀態(tài)，并給細胞提供一定的營養(yǎng)，效果通常比PBS或HBSS更好。

2.熒光顯微鏡檢測：
a.接種培養(yǎng)。將細胞接種于96孔板等多孔板、細胞培養(yǎng)皿中或者細胞爬片上，按實驗設計對細胞進行一定處理。
b.洗滌(選做)。對于貼壁細胞，吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞1遍；對于懸浮細胞，250-1000×g室溫離心5min，吸除上清，用PBS洗滌1遍。酚紅或血清對于本試劑盒的檢測有一定的干擾，吸除培養(yǎng)液和PBS時最好使用真空泵。在能充分吸凈殘留液體的情況下，可以不使用PBS洗滌。
c.染色。加入適當體積的Calcein AM/PI檢測工作液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37℃避光孵育30min。不同的細胞最佳孵育時間有所不同，以30min作為初始孵育時間，后續(xù)可以根據(jù)實際染色效果對染色時間進行適當調(diào)整和優(yōu)化，以得到更加理想的染色效果。
d.檢測。孵育結(jié)束后，在熒光顯微鏡下觀察染色效果(Calcein AM為綠色熒光，Ex/Em=494/517nm；PI為紅色熒光，Ex/Em=535/617nm)。對于貼壁細胞L929，本產(chǎn)品的熒光染色效果參考圖1。如有需要，也可進一步進行其它熒光的復染，例如使用Hoechst 33342活細胞染色液染色細胞核等。注意整個過程均需注意避光操作。

3.流式細胞儀檢測：
a.細胞準備。貼壁細胞胰酶消化后用培養(yǎng)液重懸，并用PBS洗滌一次；懸浮細胞250-1000×g室溫離心5min，棄上清，用PBS洗滌一次。每個樣品推薦的細胞用量為10⁶個細胞。
b.染色。對于上一步驟的106個細胞的沉淀，加入1ml Calcein AM/PI檢測工作液，重懸為單細胞懸液。37℃避光孵育30min。注：需要準備好僅含緩沖液的細胞樣品用作流式細胞儀檢測時的陰性對照，該緩沖液與配制Calcein AM/PI檢測工作液的緩沖液宜保持一致。同時準備兩管額外的細胞樣品，每管只加入一種染料(Calcein AM或PI)，用于流式單染的補償調(diào)節(jié)。
c.檢測。孵育完成后，可以直接進行流式細胞儀檢測，也可以250-1000×g室溫離心5min沉淀細胞，吸凈液體后每個樣品加入0.5ml緩沖液重懸細胞后用流式細胞儀檢測(Calcein AM為綠色熒光，Ex/Em=494/517nm；PI為紅色熒光，Ex/Em=535/617nm)。如有需要，也可進行進一步染色，例如使用Hoechst 33342活細胞染色液染色細胞核等。注意整個過程均需注意避光操作。染色后，將樣品置于冰上，并盡量在1小時內(nèi)進行流式細胞儀檢測和分析。
注1：使用僅含檢測緩沖液的并且未經(jīng)染色的細胞樣品用于流式細胞儀的陰性對照設置。
注2：細胞圈門(gate)時，注意不要圈入細胞碎片，并使用Calcein AM或PI單染的細胞進行調(diào)節(jié)補償。雙染細胞流式檢測應獲得兩個相對獨立的細胞群：綠色熒光的活細胞群和紅色熒光的死細胞群。
注3：由于流式檢測比較靈敏，使用的熒光探針濃度可能要比熒光顯微鏡檢測時要低，此時可根據(jù)細胞類型和實際染色情況對Calcein AM或PI的稀釋倍數(shù)進行適當調(diào)整。

4.熒光酶標儀檢測細胞死活的變化：
a.接種培養(yǎng)。將細胞接種于96孔板黑色多孔板中，如全黑96孔細胞培養(yǎng)板，每孔的細胞數(shù)需要控制在100-10,000個，通常宜在2000-5000個范圍內(nèi)。按實驗設計對細胞進行一定處理。
b.洗滌(選做)。對于貼壁細胞，吸除培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞1遍；對于懸浮細胞，250-1000×g室溫離心5min，吸除上清，用PBS洗滌1遍。酚紅或血清對于本試劑盒的檢測有一定的干擾，吸除培養(yǎng)液和PBS時最好使用真空泵。在能充分吸凈殘留液體的情況下，可以不使用PBS洗滌。
c.染色。加入適當體積的Calcein AM/PI檢測工作液，通常96孔板每孔加入100μl。37℃避光孵育30min。不同的細胞最佳孵育時間有所不同，以30min作為初始孵育時間，后續(xù)可以根據(jù)實際染色效果對染色時間進行適當調(diào)整和優(yōu)化，以得到更加理想的染色效果。
d.檢測。孵育結(jié)束后，用熒光酶標儀檢測(Calcein AM為綠色熒光，Ex/Em=494/517nm；PI為紅色熒光，Ex/Em=535/617nm)。通過對比對照組與處理組的RFU (Relative fluorescence values)，可以得出死細胞與活細胞數(shù)量的變化。

5.熒光酶標儀檢測細胞死活的比例：本方法通過設置對照，可計算出死細胞與活細胞的比例。
a.細胞培養(yǎng)和處理同前。
b.除配制Calcein AM/PI檢測工作液外，還需要配制單獨的Calcein AM檢測工作液和PI檢測工作液用于對照的檢測。配制方法和稀釋倍數(shù)與Calcein AM/PI檢測工作液的配制一致。
c.檢測樣品組和對照組設置：
對于下面組別的細胞或無細胞組，需要保持細胞數(shù)量、檢測工作液濃度、孵育時間和孵育溫度的完全一致。

活細胞組為沒有加入藥物處理的細胞；死細胞組可用0.1-0.5%洋地黃皂苷或0.1%皂素處理細胞10分鐘，或70%乙醇孵育細胞30分鐘即可得到死細胞。
d.染色和檢測步驟同前。
e.根據(jù)檢測數(shù)據(jù)計算死細胞與活細胞的比例：
% Live Cells =F(517)_sam-F(517)_min
F(517)_max-F(517)_min×100%
% Dead Cells =F(617)_sam-F(617)_min
F(617)_max-F(617)_min×100%
注1：其中所有的F(517)和F(617)都減去相應的F(517)₀和F(617)₀。
注2：如果需要確定活細胞與死細胞的具體數(shù)量，可制作不同數(shù)量活細胞與死細胞在517nm和617nm處的熒光光譜標準曲線。該標準曲線呈線性關(guān)系，因此通過標準曲線和樣品中兩個染料的熒光強度可計算出活細胞與死細胞的數(shù)量。