a. PBS或HBSS洗滌一次。
b. 如果細(xì)胞貼得不牢，可以干燥樣品使細(xì)胞貼得更牢。
c. 用碧云天生產(chǎn)的免疫染色固定液或4%多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘。
d. 用PBS或HBSS洗滌一次。
e. 加入碧云天生產(chǎn)的免疫染色強(qiáng)力通透液或含0.3% Triton X-100的PBS，室溫孵育5分鐘。
f. 轉(zhuǎn)步驟5。

2. 對(duì)于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液：
a. 收集細(xì)胞(不超過200萬細(xì)胞)，PBS或HBSS洗滌一次。
b. 用碧云天生產(chǎn)的免疫染色固定液或4%多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘。為防止細(xì)胞聚集成團(tuán)，宜在側(cè)擺搖床或水平搖床上緩慢搖動(dòng)的同時(shí)進(jìn)行固定。
c. 用PBS或HBSS洗滌一次。
d. 用碧云天生產(chǎn)的免疫染色強(qiáng)力通透液或含0.3% Triton X-100的PBS重懸細(xì)胞，室溫孵育5分鐘。
e. 轉(zhuǎn)步驟5。

3. 對(duì)于石蠟切片：
a. 二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘。90%乙醇2分鐘。70%乙醇2分鐘，蒸餾水2
分鐘。
b. 滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K(推薦使用碧云天的 蛋白酶K(20mg/ml)，用免疫染色洗滌液或10mM Tris-HCl pH7.4-7.8稀釋1000倍即為20μg/ml不含DNase的蛋白酶K)，20-37℃作用15-30分鐘(不同組織的最佳作用溫度和時(shí)間需自行摸索)。
c. PBS或HBSS洗滌3次。注意：這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈，否則會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。
d. 轉(zhuǎn)步驟5。

4. 對(duì)于冰凍切片：
a. 用碧云天生產(chǎn)的免疫染色固定液或4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60分鐘。
b. PBS或HBSS洗滌2次，每次10分鐘。
c. 加入含碧云天生產(chǎn)的免疫染色強(qiáng)力通透液或含0.5% Triton X-100的PBS，室溫孵育5分鐘。
d. 轉(zhuǎn)步驟5。

5. 配制TUNEL檢測(cè)液：
參考下表配制適當(dāng)量的TUNEL檢測(cè)液，需充分混勻。注意：配制好的TUNEL檢測(cè)液必須一次使用完畢，不能凍存。

6. 對(duì)于貼壁細(xì)胞、細(xì)胞涂片或組織切片：
a. 用PBS或HBSS洗滌2次。
b. 在樣品上加50μl TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育60分鐘。注意：50μl TUNEL檢測(cè)液適合涂片、切片或96孔板、48孔板、24孔板或12孔板的一個(gè)孔，如果是6孔板中的一個(gè)孔TUNEL檢測(cè)液宜使用100μl。如果待檢測(cè)的樣品為涂片、切片或在24孔板、12孔板或6孔板中，可以使用防蒸發(fā)膜，或自行嘗試使用自封袋或者其它適當(dāng)材料自行裁剪成比孔略小的圓形塑料片，滴加TUNEL檢測(cè)液后覆蓋在樣品上，可以防止TUNEL檢測(cè)液蒸發(fā)，并且使TUNEL檢測(cè)液均勻覆蓋樣品。自行裁剪圓片時(shí)需要連著圓片突出一個(gè)角或連著一條，并將圓形之外的突出部分折疊，方便染色結(jié)束后利用突出部分順利取出圓片。也可以用PAP Pen圈出一個(gè)區(qū)域進(jìn)行染色。孵育時(shí)需注意在多余的孔和多孔板的空隙中加入適量水以保持濕潤(rùn)，從而盡量減少TUNEL檢測(cè)液的蒸發(fā)
c. PBS或HBSS洗滌3次。
d. 用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察�？梢允褂玫募ぐl(fā)波長(zhǎng)范圍為450-500nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為515-565nm(綠色熒光)。染色效果可參見圖1。

7. 對(duì)于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液：
a. 用PBS或HBSS洗滌2次。
b. 加入50μl TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育60分鐘。
c. PBS或HBSS洗滌2次。
d. 用250-500μl PBS或HBSS懸浮。
e. 此時(shí)可以用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)或涂片后在熒光顯微鏡下觀察�？梢允褂玫募ぐl(fā)波長(zhǎng)范圍為450-500nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為515-565nm(綠色熒光)。

常見問題：
1. 出現(xiàn)非特異性熒光標(biāo)記。
a. 有些細(xì)胞或組織，例如平滑肌細(xì)胞或組織，nuclease或polymerase的酶活性水平較高，易導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的熒光標(biāo)記。解決方法是，取細(xì)胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導(dǎo)致假陽性。
b. 使用了不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ�，例如一些酸性固定液，�?dǎo)致出現(xiàn)假陽性。建議采用推薦的固定液。
c. TUNEL檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，或TUNEL檢測(cè)反應(yīng)過程中反應(yīng)液滲漏，細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤(rùn)，也可能出現(xiàn)非特異性熒光。注意控制反應(yīng)時(shí)間，并確保TUNEL檢測(cè)反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。
2. 熒光背景很高。
a. 支原體污染。請(qǐng)使用支原體染色檢測(cè)試劑盒檢測(cè)是否為支原體污染。支原體染色檢測(cè)試劑盒可以向碧云天訂購。
b. 高速分裂和增殖的細(xì)胞，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA斷裂。
c. TUNEL反應(yīng)過強(qiáng)�？梢杂迷噭┖刑峁┑腡dT酶稀釋液稀釋TdT酶2-5倍后再按照說明書操作。稀釋后的TdT酶需當(dāng)日使用。
d. 紅細(xì)胞中血紅蛋白導(dǎo)致的自發(fā)熒光產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。此時(shí)宜選擇其它細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒。
3. 標(biāo)記效率低。
a. 使用乙醇或甲醇固定會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記的效率較低。
b. 固定時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致交聯(lián)程度過高。此時(shí)宜減少固定時(shí)間。
c. 熒光淬滅。熒光在普通光照10分鐘就會(huì)嚴(yán)重淬滅。解決方法是需注意避光操作。
d. 碘化丙啶雙染時(shí)，如果碘化丙啶染色過深會(huì)導(dǎo)致觀察到的本試劑盒的TUNEL染色效果減弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激發(fā)產(chǎn)生的熒光，從而起到淬滅作用。解決方法是用較低濃度的碘化丙啶染色，例如0.5μg/ml碘化丙啶。
e. 貼壁細(xì)胞如果使用藥物誘導(dǎo)凋亡，會(huì)使發(fā)生凋亡細(xì)胞的貼壁性會(huì)減弱，所以建議在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，用可以對(duì)多孔板進(jìn)行離心的離心機(jī)1000g離心5分鐘，然后再吸除培養(yǎng)基并用PBS洗滌。如果沒有適合的離心機(jī)，請(qǐng)注意操作輕緩，防止發(fā)生凋亡的細(xì)胞在洗滌時(shí)洗去。后續(xù)整個(gè)操作也需要輕緩。