生物制藥生產(chǎn)中去除DNA的明智選擇——優(yōu)化Benzonase®核酸內(nèi)切酶在病毒產(chǎn)品純化中的使用
 
 
Benzonase®核酸內(nèi)切酶——生物制藥生產(chǎn)中去除DNA的明智選擇，其價值已在過去的30多年里予以了證明。使用Benzonase®核酸內(nèi)切酶的生產(chǎn)遵循GMP (ICH Q7)，從而提供了高質(zhì)可靠的產(chǎn)品，以此平衡工藝的高效性和法規(guī)的要求。所有Benzonase®核酸內(nèi)切酶產(chǎn)品具有相同的核酸序列（經(jīng)LC-MS/MS質(zhì)譜分析證實）、穩(wěn)健性和活性。
 
作為一種沒有堿基偏好性的核酸內(nèi)切酶，它們可以將DNA和RNA降解為3到5個堿基對(<6 kDa)的小片段，是監(jiān)管機構(gòu)要求的病毒載體和疫苗生產(chǎn)中去除核酸的理想工具。使用Benzonase®核酸內(nèi)切酶可進一步增加病毒純化的收率，保護下游層析和過濾裝置不受污染，并且降低料液粘度。
 
為什么要優(yōu)化Benzonase®核酸內(nèi)切酶在生產(chǎn)工藝中的使用？
 
Benzonase®核酸內(nèi)切酶是一款高質(zhì)量產(chǎn)品，可為工藝帶來巨大價值。關(guān)鍵在于要以較經(jīng)濟的方式使用它。由于Benzonase®核酸內(nèi)切酶活性在很大程度上受到其所應(yīng)用基質(zhì)環(huán)境的影響，故其應(yīng)用優(yōu)化應(yīng)當(dāng)是工藝開發(fā)中必不可少的關(guān)鍵步驟。
 
在本方案中，我們將提供如何規(guī)劃和建立Benzonase®核酸內(nèi)切酶實驗設(shè)計（DoE）優(yōu)化實驗的指引。請注意，雖然在本方案中并未涉及Benzonase®核酸內(nèi)切酶使用點（如在生物反應(yīng)器中、細胞裂解后或澄清后操作）的優(yōu)化，但就整體優(yōu)化而言，則也應(yīng)予以考慮。
 
優(yōu)化流程
1、DoE介紹
實驗設(shè)計(DoE)是指利用統(tǒng)計學(xué)規(guī)劃、實施和分析多個因子對一個或一組參數(shù)的影響。DoE是一種強大的工具，可用于各種實驗情況，如優(yōu)化酶的反應(yīng)條件。為Benzonase®核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用建立DoE，有助于找到最佳操作條件，達到工藝中所需的DNA清除率。
 
2、DoE設(shè)計
為了建立符合DoE概念的實驗系列，建議首先定義常數(shù)因子、具有中心點起始條件的輸入變量和輸出參數(shù)。
 
① 定義常數(shù)因子
✦需已知樣品材料的平均DNA載量，用于計算所需酶量；
 
✦由于病毒生產(chǎn)上游工藝的材料成分復(fù)雜，應(yīng)用也各不相同，但Benzonase®核酸內(nèi)切酶的優(yōu)化目標是一致的。因此，可將其視為常數(shù)因子，以及由培養(yǎng)環(huán)境產(chǎn)生的pH值和鹽濃度也可視為常數(shù)因子。有關(guān)不同化學(xué)品對Benzonase®核酸內(nèi)切酶性能的影響概述，請參考我們的產(chǎn)品手冊；
 
✦由于Mg2+濃度是Benzonase®核酸內(nèi)切酶發(fā)揮作用的最關(guān)鍵參數(shù)，因此應(yīng)始終保持2mM的常量；
 
✦培養(yǎng)容器和混合工藝過程應(yīng)始終保持不變。
 
② 定義輸入變量
平衡Benzonase®核酸內(nèi)切酶的作用效果取決于：
 
✦Benzonase®濃度
✦孵育時間
✦孵育溫度
 
③ 定義輸出
由于Benzonase®核酸內(nèi)切酶應(yīng)用的目標是DNA消化，因此關(guān)鍵輸出為：
 
✦DNA含量>100 bp片段
✦產(chǎn)品完整性
 
3、已定義變量的中心點起始條件
建議設(shè)置以下起始點：
 
✦孵育時間設(shè)置為2個小時
✦孵育溫度設(shè)置為室溫，如21°C
 
Benzonase®核酸內(nèi)切酶在標準測定條件下的理論濃度，根據(jù)下列公式，基于各樣品材料的DNA含量得出： Benzonase®核酸內(nèi)切酶用量應(yīng)當(dāng)基于隨產(chǎn)品提供的COA給定的實際活性（單位為U/µL）而定。
 
4、DoE實驗方案
 
下表建議Benzonase®核酸內(nèi)切酶優(yōu)化實驗設(shè)置的第一種方法。這種方法選擇三種溫度條件，分別為37°C、室溫和4°C，同時選擇1、2、6個小時的三種典型培養(yǎng)時間。結(jié)合三種Benzonase®核酸內(nèi)切酶濃度，是理論濃度的x倍。
  ▲表一：建議實驗設(shè)計
 
5、檢測Benzonase®核酸內(nèi)切酶效力
 
基于Benzonase®核酸內(nèi)切酶的DNA消化應(yīng)當(dāng)使用宿主細胞DNA的100- 200堿基對片段的特定qPCR方法進行監(jiān)測。完整的DNA經(jīng)過Benzonase®核酸內(nèi)切酶消化后降解成3到5個堿基對的片段，限制熒光DNA嵌入染料測定的效用，后者可檢測小至4個堿基對的DNA片段。建議選擇合適的對照實驗來確定消化工藝過程，從而確保穩(wěn)健的結(jié)果。
 
DoE結(jié)果和后續(xù)步驟說明：
上表中建議的實驗設(shè)計是根據(jù)影響DNA/RNA消化的主要參數(shù)提出的建議�？筛鶕�(jù)您當(dāng)前的資源，減少試驗次數(shù)或者增加更多的條件。一旦執(zhí)行設(shè)計，建議首先證實生成數(shù)據(jù)是否與最初實驗假設(shè)相一致。然后充分分析和解釋結(jié)果。這可能需要進一步的試驗或基于縮窄圍繞已確定最優(yōu)值的參數(shù)值范圍再進行DoE。此外，應(yīng)考慮對生產(chǎn)工藝過程中的使用點（如在生物反應(yīng)器中、細胞裂解后或澄清后）進行優(yōu)化，以實現(xiàn)Benzonase®核酸內(nèi)切酶最具經(jīng)濟性的表現(xiàn)。
 
適用于GMP生產(chǎn)的Benzonase®：  
 
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