如何避免IP檢測過程中的重鏈干擾與輕鏈干擾
免疫沉淀 (Immunoprecipitation，IP) 是利用抗原抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法�？贵w與細胞裂解液或表達上清中相應的蛋白結合后，再與ProteinA/G偶聯(lián)的agarose或Sepharose珠子孵育，通過離心得到珠子-蛋白A/G-抗體-目的蛋白復合物，沉淀經(jīng)過洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5-10min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。
在免疫沉淀實驗后的WB驗證環(huán)節(jié)中，當使用常規(guī)的 Anti-IgG (H+L) 酶標二抗時，通常會出現(xiàn)對應免疫沉淀一抗變性后產生的重鏈（50kDa）和輕鏈（25kDa）兩條帶。如果檢測的目的蛋白分子量在此附近時，就會受到這兩條帶的干擾。
如何避免IP檢測過程中的重、輕鏈干擾，AmyJet可為您提供兩種方案：
方案一：選擇WB一抗時，選擇和IP用一抗不同的種屬，避免IP一抗的干擾
| IP捕獲抗體類型 | WB檢測時一抗類型 | WB檢測時二抗類型 | 備注說明 |
| 小鼠單抗/多抗 | 兔多抗 | HRP-標記抗兔IgG二抗 | 由于 IP 捕獲抗體與 WB 檢測一抗屬于不同種屬來源抗體，故WB 檢測時使用 HRP-標記抗兔 IgG 二抗可以有效避免重鏈輕鏈信號的影響。 |
| 兔多抗 | 小鼠單抗 | HRP-標記抗小鼠IgG二抗 | 由于IP捕獲抗體與WB檢測一抗屬于不同種屬來源抗體，故WB檢測時使用HRP-標記抗小鼠IgG二抗可以有效避免重鏈輕鏈信號的影響。 |
| 小鼠多抗 |
| 貨號 | 名稱 | 應用類型 |
| AMJ-AB2003 | 山羊抗兔IgG二抗，HRP標記 | WB，IHC，ELISA |
| AMJ-AB2002 | 山羊抗小鼠IgG二抗，HRP標記 | WB，IHC，ELISA |
方案二：選擇只和重鏈或輕鏈反應的二抗
如果目標蛋白分子量小于30KD，為了避免抗體輕鏈的干擾，選擇重鏈特異性二抗；如果目標蛋白分子量大于30KD，為了避免抗體重鏈的干擾，選擇輕鏈特異性二抗。
| 類型 | 貨號 | 名稱 | 應用類型 |
| 無重鏈干擾 | AMJ-AB2016 | IP™ 山羊抗小鼠IgG輕鏈二抗，HRP標記 | WB，IP |
| AMJ-AB2017 | IP™ 小鼠抗兔IgG輕鏈二抗，HRP標記 | WB，IP | |
| 無輕鏈干擾 | AMJ-AB2018 | IP™ 山羊抗小鼠IgG重鏈二抗，HRP標記 | WB，IP |
| AMJ-AB2019 | IP™ 山羊抗兔IgG重鏈二抗，HRP標記 | WB，IP |
IP實驗常見問題匯總：
| 結果 | 原因 | 解析 |
| 顯影信號整體很弱，熒光信號淬滅 | 顯影液失效 | 通過檢查顯影液清澈度初判，并通過立即更換新顯影液后再曝 |
| 底物失效 | 將PVDF膜重新TBST略洗幾次，重新加合格的底物 | |
| 二抗孵育過多 | 如果操作較快，會出現(xiàn)第1張膠片曝光后信號極強，而第2張起可能信號淬滅；如果操作稍慢點，甚至第1張膠片起信號基本淬滅，這種情況建議重做，降低二抗?jié)舛取p少孵育時間 | |
| 條帶正確，但顯影過強或過弱 | 上樣量過大 | 可減小上樣量、提高一抗稀釋度并縮短曝光時間 |
| 上樣量過小 | 可增加上樣量、降低一抗稀釋度并延長曝光時間 | |
| 背景雜亂厚重，大片“黑區(qū)”，導致無法分析 | 一抗孵育時間過長 或濃度過高 |
4℃封閉過夜，一抗孵育1 hr，并可適當增加洗膜時間 |
| Input泳道無目的帶，而IP泳道有 | 目的蛋白豐度不高，無法直接 Western blot 檢出，而 IP 能進行濃縮富集 | |
| Input泳道有目的帶，而IP泳道無 | 該種一抗主要識別和結合靶蛋白內部的線性表位、而非暴露在外表的的線性或空間表位，故IP制樣時無法有效捕獲住組織或細胞中的完整結構靶蛋白 | |
| 該蛋白濃度極低，導致捕獲過程不僅未起到富集作用，反而因為洗滌操作，使靶蛋白損失殆盡，最后幾乎無靶蛋白被洗脫下來；或lysis buffer過強；或選用了不正確的beads； 或一抗亞型為 IgM 或 IgA | ||
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