在過去的十年里，小RNAs（small RNA）已經(jīng)成為基因表達和基因組功能的重要調(diào)節(jié)因子，幾乎在生物學(xué)的各個方面都發(fā)揮著作用。許多小RNAs通過RNA干擾（RNAi）相關(guān)機制發(fā)揮作用，這些機制通過對RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC）進行編程以識別和抑制目標(biāo)。還有一類天然microRNAs（miRNAs），可在體內(nèi)調(diào)節(jié)基因表達程序。miRNA功能的改變是導(dǎo)致人類疾病的一個重要因素，而對特定miRNA的調(diào)控正成為一種新的治療手段。小RNA的用途遠不止如此，快來跟小編一起深入了解small RNA—從功能研究到基因治療。

（1）小RNA 起源
目前，我們對于通過RISC發(fā)揮作用的小RNAs的發(fā)生，認識比較全面。在動物中，這種小RNAs主要有三類：小干擾RNA（siRNAs）、PIWI相互作用RNA（piRNAs）和miRNAs。siRNAs是由RNAseⅢ家族酶dicer處理的雙鏈前體衍生而來。在哺乳動物中，內(nèi)源性siRNA在生殖細胞中較為豐富，但在無脊椎動物中則更為廣泛。miRNA前體包含成熟miRNA序列的短發(fā)夾片段。這些前體通過兩個雙鏈RNA酶（dsRNA酶）Drosha和Dicer的串聯(lián)作用進行處理。piRNAs主要在生殖細胞中表達，在生殖細胞中它們保護轉(zhuǎn)座子的活性。它們的生物起源仍有待充分了解。
（2）小RNA 發(fā)現(xiàn)
下一代測序技術(shù)使小RNAs的研究發(fā)生了革命性的改變。在將特定的連接子連接到小RNAs之后，可以生成cDNAs，這非常適合使用短讀平臺進行測序。這些方法擴大了被認為通過RISC起作用的小RNAs的種類，并使人們能夠發(fā)現(xiàn)新的小RNAs。深度測序也被證明有助于檢測特殊小RNA的表達；另一方面，如微陣列和定量pcr（qpcr），也提供了經(jīng)濟的替代方案，目前數(shù)據(jù)庫已經(jīng)在線提供已知的小RNA庫。
（3）小RNA 功能研究
了解小RNAs的功能通常從研究它們的表達模式開始。潛在靶點的識別依賴于小RNA和靶點必須具有一定的序列互補性的假設(shè)。計算算法根據(jù)miRNA-mRNA相互作用的假定特征及其結(jié)合位點的保守性預(yù)測miRNA靶點。此外，還發(fā)展了幾種生物化學(xué)方法，如交聯(lián)免疫沉淀法（CLIP）和串聯(lián)親和純化miRNA靶基因mRNAs（Tap-Tar）。小RNAs的功能研究可以依賴于常規(guī)的遺傳策略，如基因敲除。miRNA的過度表達和miRNA拮抗劑的使用也是常用的方法。拮抗劑是化學(xué)合成的miRNA互補寡核苷酸，其修飾的化學(xué)骨架可作為miRNA功能的反義抑制劑。模式生物，如秀麗隱桿線蟲、果蠅和斑馬魚，也被證明是理解保守小RNAs功能的關(guān)鍵。
（4）小RNA 工具類型
小rna通路的抑制潛能可以被重新定位到選定的細胞基因，使基因功能的研究成為可能。在哺乳動物中，有兩種類型的RNAi triggers被廣泛應(yīng)用。通常在培養(yǎng)過程中，siRNAs被瞬時傳遞到細胞中，并進入RISC而無需進一步處理。shRNAs必須利用瞬時傳遞或基因組整合的載體進行表達，并且必須經(jīng)過Drosha和Dicer或Dicer酶處理。siRNAs簡單易用，但由于化學(xué)合成的triggers的持續(xù)性，它們只能暫時使目標(biāo)沉默。shRNAs提供了更大的靈活性；整合的結(jié)構(gòu)可以提供長久性的抑制，shRNAs本身可以由受調(diào)控的啟動子表達，從而能夠調(diào)節(jié)抑制水平并檢查可逆效應(yīng)。
（5）小RNA 篩選工具
小RNA工具徹底改變了全基因組檢測以尋找對特定表型有影響的蛋白質(zhì)的能力。在哺乳動物全基因組和亞基因組中，合成siRNAs或shRNA表達載體的文庫被廣泛使用。此外，長dsRNAs文庫已廣泛應(yīng)用于蠕蟲和果蠅黑原細胞中，而且很容易獲得表達dsRNA觸發(fā)因子的轉(zhuǎn)基因蒼蠅的文庫。
（6）體內(nèi)研究策略
短發(fā)夾RNAs（shRNAs）是研究轉(zhuǎn)基因動物基因功能的有力工具。通過移植shRNAs修飾的干細胞，可以培育出敲除目的基因的動物。這可以通過將優(yōu)化的shRNAs整合到能夠在大多數(shù)組織中表達的特定基因組位點來實現(xiàn)。這種策略為實現(xiàn)組織或細胞類型中任何基因的組織特異性或調(diào)節(jié)性抑制提供了可能。
（7）小RNAs 靶向治療
miRNAs自身或關(guān)鍵靶點結(jié)合位點的改變與人類疾病有關(guān)。這使得對特定miRNA的調(diào)控正成為一種新的治療手段，目前已經(jīng)開發(fā)了幾種在體內(nèi)釋放拮抗劑的策略。這些方法已在包括嚙齒動物和靈長類動物在內(nèi)的臨床前模型中得到驗證，一些miRNA拮抗劑已進入人類臨床試驗。
（8）小RNA基因治療應(yīng)用前景
利用小RNAs的單基因和全基因組方法在發(fā)現(xiàn)各種疾病的新治療靶點方面都具有很大的潛力。這些靶點中有些屬于蛋白質(zhì)類，這些蛋白質(zhì)類可用于常規(guī)藥物的發(fā)現(xiàn)。還有一部分被認為是“無成藥性”的蛋白質(zhì)類。在這些情況下，小RNAs本身提供了一種新的治療方法，盡管將小RNA輸送到體內(nèi)的靶細胞具有挑戰(zhàn)性，但許多研究小組已在尋求在特定疾病環(huán)境中表達shRNAs的基因治療方法。


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•shRNA——microRNA適配的shRNA，用于組成型和誘導(dǎo)型RNAi，提供特異和有效的長期沉默。

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參考文獻：

Chang K, Hannon G J. Tools for studying and using small RNAs: from pathways to functions to therapies[J]. Nature Reviews, Genetics Sep, 2014, 18.

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