一起學(xué)習(xí)多種細(xì)胞快速檢測的方法吧
小編前陣子去學(xué)了CPR，第一個步驟就是要先確認(rèn)倒在那里的人是不是還…活著。
“先生先生，你怎么了?”（拍拍肩膀）
讓小編開始好奇，我的細(xì)胞“要怎么判斷他們是死是活呢？它們活的好嗎?”
活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶，能使額外添加的MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，死細(xì)胞則無此現(xiàn)象。接著用二甲基亞砜（DMSO）溶解沉積在細(xì)胞中的甲瓚后，可利用酶標(biāo)儀490nm波長測光吸收值，依據(jù)吸光值（OD值）計算出活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，吸光值與細(xì)胞活性成正比（下圖1）。
“先生先生，你怎么了?”（拍拍肩膀）
我們可以簡單將分析細(xì)胞活力和增殖測定的方法分成5大類：
1. 代謝增殖測定
2. DNA合成增殖試驗(yàn)
3. 化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性測定
4. 熒光染料增殖試驗(yàn)
5. 臺盼藍(lán)細(xì)胞計數(shù)
以下簡單介紹這些分類的幾種常見實(shí)驗(yàn)方式吧�。ㄋ袌D片可點(diǎn)擊放大）
代謝增殖測定
MTT檢測法
活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶，能使額外添加的MTT還原為不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，死細(xì)胞則無此現(xiàn)象。接著用二甲基亞砜（DMSO）溶解沉積在細(xì)胞中的甲瓚后，可利用酶標(biāo)儀490nm波長測光吸收值，依據(jù)吸光值（OD值）計算出活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，吸光值與細(xì)胞活性成正比（下圖1）。
∆ 圖1
XTT檢測法
與MTT原理相似，皆是利用添加物與活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，并利用酶標(biāo)儀測定產(chǎn)物光吸收值；不同于MTT法的是，XTT法還原產(chǎn)物是水溶性的橙黃色甲肷，不需經(jīng)過二甲基亞砜（DMSO）溶解步驟，即可直接測定光吸收值（BI，貨號：20-300-1000），操作較MTT方便快速。當(dāng)XTT與電子耦合劑作用后產(chǎn)生的水溶性甲肷吸光值與活細(xì)胞數(shù)成正比（下圖2）。
與MTT原理相似，皆是利用添加物與活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，并利用酶標(biāo)儀測定產(chǎn)物光吸收值；不同于MTT法的是，XTT法還原產(chǎn)物是水溶性的橙黃色甲肷，不需經(jīng)過二甲基亞砜（DMSO）溶解步驟，即可直接測定光吸收值（BI，貨號：20-300-1000），操作較MTT方便快速。當(dāng)XTT與電子耦合劑作用后產(chǎn)生的水溶性甲肷吸光值與活細(xì)胞數(shù)成正比（下圖2）。
∆ 圖2
DNA合成增殖試驗(yàn)
BrdU檢測法
BrdU為胸腺嘧啶核苷（Thymine）的衍生物，可用于標(biāo)記活細(xì)胞中新合成的DNA（細(xì)胞活性周期S期），BrdU可隨著DNA復(fù)制進(jìn)入子細(xì)胞，因此在加入BrdU后分裂增殖的細(xì)胞DNA都會帶有BrdU標(biāo)記，可通過抗BrdU單克隆抗體檢測，借此檢測細(xì)胞的增殖能力，但BrdU單克隆抗體檢測過程需要將部分DNA變性，使部分雙股解開成單股才能順利檢測（下圖3）。且BrdU為光敏性，因此需要在光線刺激較低（黑暗）的環(huán)境下操作，并避光培養(yǎng)。
BrdU為胸腺嘧啶核苷（Thymine）的衍生物，可用于標(biāo)記活細(xì)胞中新合成的DNA（細(xì)胞活性周期S期），BrdU可隨著DNA復(fù)制進(jìn)入子細(xì)胞，因此在加入BrdU后分裂增殖的細(xì)胞DNA都會帶有BrdU標(biāo)記，可通過抗BrdU單克隆抗體檢測，借此檢測細(xì)胞的增殖能力，但BrdU單克隆抗體檢測過程需要將部分DNA變性，使部分雙股解開成單股才能順利檢測（下圖3）。且BrdU為光敏性，因此需要在光線刺激較低（黑暗）的環(huán)境下操作，并避光培養(yǎng)。
∆ 圖3
EdU檢測法
EdU原理跟BrdU檢測法很像，都是代替胸腺嘧啶（Thymine, T）滲入正在復(fù)制的DNA中，并加入能與Edu反應(yīng)的熒光染料，即可利用檢測熒光值偵測應(yīng)用于細(xì)胞增殖，或在細(xì)胞組織級別作為標(biāo)記追蹤等研究（下圖4），實(shí)驗(yàn)過程不需要經(jīng)過BrdU檢測法的DNA變性處理。
ATP是細(xì)胞的能量直接來源，ATP發(fā)光法是藉由檢測細(xì)胞內(nèi)ATP含量來分析細(xì)胞增殖。市面上的原理是利用外源的螢火蟲熒光素（Luciferin）與熒光素酶（Luciferase），以細(xì)胞內(nèi)含的ATP為能量來源，發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生生物冷光，因此可通過監(jiān)測冷光光度，來對應(yīng)ATP含量并判斷細(xì)胞增殖狀況（下圖5）。
∆ 圖5
熒光染料增殖試驗(yàn)
∆ 圖6
臺盼藍(lán)細(xì)胞計數(shù)
∆ 圖7
EdU原理跟BrdU檢測法很像，都是代替胸腺嘧啶（Thymine, T）滲入正在復(fù)制的DNA中，并加入能與Edu反應(yīng)的熒光染料，即可利用檢測熒光值偵測應(yīng)用于細(xì)胞增殖，或在細(xì)胞組織級別作為標(biāo)記追蹤等研究（下圖4），實(shí)驗(yàn)過程不需要經(jīng)過BrdU檢測法的DNA變性處理。
∆ 圖4
化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性測定
ATP發(fā)光法
化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性測定
ATP是細(xì)胞的能量直接來源，ATP發(fā)光法是藉由檢測細(xì)胞內(nèi)ATP含量來分析細(xì)胞增殖。市面上的原理是利用外源的螢火蟲熒光素（Luciferin）與熒光素酶（Luciferase），以細(xì)胞內(nèi)含的ATP為能量來源，發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生生物冷光，因此可通過監(jiān)測冷光光度，來對應(yīng)ATP含量并判斷細(xì)胞增殖狀況（下圖5）。
∆ 圖5
熒光染料增殖試驗(yàn)
CFSE檢測法
CFSE是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，具有細(xì)胞膜通透性，能夠自由進(jìn)入細(xì)胞；當(dāng)CFSE擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜，會與細(xì)胞內(nèi)源酯酶產(chǎn)生水解反應(yīng)而被激發(fā)，發(fā)出綠色熒光，這些帶熒光的CFSE會進(jìn)一步與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合，形成穩(wěn)定的胞內(nèi)熒光蛋白。每當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖，胞內(nèi)熒光蛋白會被平均分配到下一代細(xì)胞中，因此細(xì)胞熒光強(qiáng)度會隨著增殖代數(shù)增加而不斷地降低（下圖6），可用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步偵測分析得出細(xì)胞分裂增殖的情況。CFSE的濃度，對于最終判斷細(xì)胞增殖結(jié)果有直接性的影響！
CFSE是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料，具有細(xì)胞膜通透性，能夠自由進(jìn)入細(xì)胞；當(dāng)CFSE擴(kuò)散穿過細(xì)胞膜，會與細(xì)胞內(nèi)源酯酶產(chǎn)生水解反應(yīng)而被激發(fā)，發(fā)出綠色熒光，這些帶熒光的CFSE會進(jìn)一步與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合，形成穩(wěn)定的胞內(nèi)熒光蛋白。每當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖，胞內(nèi)熒光蛋白會被平均分配到下一代細(xì)胞中，因此細(xì)胞熒光強(qiáng)度會隨著增殖代數(shù)增加而不斷地降低（下圖6），可用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步偵測分析得出細(xì)胞分裂增殖的情況。CFSE的濃度，對于最終判斷細(xì)胞增殖結(jié)果有直接性的影響！
∆ 圖6
臺盼藍(lán)細(xì)胞計數(shù)
臺盼藍(lán)（Trypan Blue）計數(shù)法
臺盼藍(lán)（BI，貨號：03-102-1B）是一種藍(lán)色細(xì)胞活性染料，無法通過結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部；但細(xì)胞死后，喪失細(xì)胞膜穩(wěn)定性，臺盼藍(lán)會進(jìn)入細(xì)胞將細(xì)胞染成藍(lán)色，因此在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，被常規(guī)地搭配自動細(xì)胞計數(shù)儀或血球計數(shù)板，應(yīng)用于區(qū)分辨活細(xì)胞和死細(xì)胞、及檢測細(xì)胞膜的完整性（如下圖7）。
臺盼藍(lán)（BI，貨號：03-102-1B）是一種藍(lán)色細(xì)胞活性染料，無法通過結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部；但細(xì)胞死后，喪失細(xì)胞膜穩(wěn)定性，臺盼藍(lán)會進(jìn)入細(xì)胞將細(xì)胞染成藍(lán)色，因此在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，被常規(guī)地搭配自動細(xì)胞計數(shù)儀或血球計數(shù)板，應(yīng)用于區(qū)分辨活細(xì)胞和死細(xì)胞、及檢測細(xì)胞膜的完整性（如下圖7）。
∆ 圖7
THE END
當(dāng)然，隨著科技的日新月異，會有越來越多更精確的實(shí)驗(yàn)方法等著大家去學(xué)習(xí)研究。
您實(shí)驗(yàn)室都在用什么方法測定細(xì)胞活性呢? 快在下面留言跟我們分享噢！
Reference
-
參考網(wǎng)站：http://tinyurl.com/yyhapr9x
-
Riss, Terry L., et al. "Cell viability assays." Assay Guidance Manual [Internet]. Eli Lilly & Company
and the National Center for Advancing Translational Sciences, 2016.
·END·
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標(biāo)簽：
代謝增值測定 化學(xué)發(fā)光 熒光染料 DNA合成
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