2016年京都大學(xué)Miyazaki團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)在人hPSC傳代培養(yǎng)期間，可以向細(xì)胞懸浮液中添加層粘連蛋白iMatrix-511，這樣可以省略在培養(yǎng)皿上預(yù)包被的過(guò)程。在此之前，都公認(rèn)必須要花費(fèi)數(shù)小時(shí)對(duì)培養(yǎng)皿進(jìn)行預(yù)包被以增強(qiáng)細(xì)胞附著性。另外，使用非包被法添加iMatrix-511，能減少這種細(xì)胞外基質(zhì)的使用量，但功效卻與對(duì)培養(yǎng)皿采取預(yù)包被法時(shí)相同。最后，該團(tuán)隊(duì)還證實(shí)了iMatrix-511的添加還能支持hPSC單細(xì)胞傳代的長(zhǎng)期維持。通過(guò)使用非包被的iMatrix-511，hPSC的擴(kuò)增可以變得更加有效，成本更低且更省時(shí)省力。
 
實(shí)驗(yàn)方法
將hPSC鋪在含有10μM Y-27632和培養(yǎng)基質(zhì)的培養(yǎng)基中。對(duì)于使用iMatrix-511非包被法的一般培養(yǎng)，iMatrix-511的濃度為0.25μg/cm²。例如，在無(wú)任何包被的6孔板的單孔中，加入含5μL 0.5mg/mL iMatrix-511母液的2mL細(xì)胞懸浮液，以進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。接種后，以TeSR-E8和StemFit AK03培養(yǎng)基培養(yǎng)hESC H9細(xì)胞系和hiPSC（人體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）253G1細(xì)胞系。每4天用0.5×胰酶和5mM EDTA/DPBS組成的細(xì)胞消化液在室溫下處理細(xì)胞5min來(lái)進(jìn)行傳代。培養(yǎng)基的體積為200μL/cm²。
 
在非包被法下生長(zhǎng)的hPSC的特征
實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)通過(guò)一系列方法評(píng)估了在非包被法下長(zhǎng)期培養(yǎng)的hPSC是否正常。使用iMatrix-511的非包被法，hPSC能連續(xù)傳代，并傳代超過(guò)10次。與預(yù)包被法下培養(yǎng)的細(xì)胞類似，在非包被法下培養(yǎng)的hPSC增殖良好并保持正常的細(xì)胞形態(tài)。此外，它們能高度表達(dá)代表性的未分化細(xì)胞表面標(biāo)志物SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60和Tra-1-81，并且不表達(dá)SSEA-1，表明了其持續(xù)的未分化狀態(tài)與以常規(guī)的預(yù)包被法下生長(zhǎng)的細(xì)胞相似（圖1a）。團(tuán)隊(duì)對(duì)非包被法生長(zhǎng)的hPSC進(jìn)行了qPCR分析，也證明了hPSC處于未分化狀態(tài)。與預(yù)包被法相比，兩者的未分化標(biāo)記基因的表達(dá)水平很相似（圖1b），表明了非包被法和預(yù)包被法中生長(zhǎng)的hPSC的未分化狀態(tài)幾乎沒(méi)有差異。核型分析顯示，非包被法不影響hPSC的穩(wěn)定性（圖1c，補(bǔ)充圖3）。這些結(jié)果表明即使在連續(xù)傳代培養(yǎng)后，非包被法也能維持hPSC的未分化狀態(tài)。最后，團(tuán)隊(duì)評(píng)估了在非包被法中生長(zhǎng)的hPSC分化成不同細(xì)胞系的潛力。hPSC可正常形成胚狀體。通過(guò)與誘導(dǎo)前的基因表達(dá)進(jìn)行比較，胚狀體對(duì)于三胚層特異的標(biāo)記基因的表達(dá)會(huì)高度上升，表明它們保持著分化潛力（圖1d）。因此，團(tuán)隊(duì)得出結(jié)論，在非包被法下生長(zhǎng)的hPSC能維持其多能性，并且非包被法可以應(yīng)用于hPSC日常的連續(xù)傳代培養(yǎng)。

圖1. 在非包被法下生長(zhǎng)的hPSC的特征。（a）具代表性的未分化標(biāo)記物的流式細(xì)胞分析。途中灰色陰影區(qū)域?yàn)殛幮詫?duì)照。（b）未分化標(biāo)記基因的qPCR分析。圖中顯示了非包被法下生長(zhǎng)的經(jīng)29次傳代的hPSC與在預(yù)包被法下生長(zhǎng)的經(jīng)10次傳代的hPSC的相對(duì)表達(dá)。（c）G帶正常核型分析。hESC H9細(xì)胞系具有正常的核型（46，XX）。（d）用于胚狀體分化的標(biāo)記基因的qPCR分析。hPSC在非包被法下培養(yǎng)，然后用14天將其誘導(dǎo)成胚狀體。通過(guò)分析TaqMan hPSC Scorecard 序列檢測(cè)的單組數(shù)據(jù)，將具代表性的分化標(biāo)記基因的表達(dá)與胚狀體形成前該基因的表達(dá)進(jìn)行比較，結(jié)果表示如圖所列的基因組的表達(dá)有著超過(guò)兩倍的增長(zhǎng)。數(shù)據(jù)是從在非包被法下生長(zhǎng)了10代的hPSC中收集的。

結(jié)論
iMatrix-511在作為培養(yǎng)基補(bǔ)充劑，添加時(shí)能有效地支持細(xì)胞粘附，但它可以不通過(guò)預(yù)包被法來(lái)實(shí)現(xiàn)。與其他的基質(zhì)蛋白不同，與預(yù)包被法相比，非包被法中iMatrix-511以低得多的濃度來(lái)支持細(xì)胞粘附和長(zhǎng)期擴(kuò)增。這種使用iMatrix-511的新方法可以降低hPSC維持的成本和時(shí)間。

參考文獻(xiàn)：
Miyazaki, Takamichi , et al. "Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner." Scientific Reports 7(2017):41165.