還原型谷胱甘肽（reduced glutathione, GSH）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

GSH 是細(xì)胞內(nèi)最主要的抗氧化巰基物質(zhì)，在抗氧化、蛋白質(zhì)巰基保護(hù)和氨基酸跨膜運(yùn)輸?shù)戎芯哂兄匾�作用。還原型與氧化型比值（GSH/GSSG）是細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的主要?jiǎng)討B(tài)指標(biāo)。因此，測(cè)定細(xì)胞內(nèi) GSH 和 GSSG 含量以及 GSH/GSSG 比值，能夠很好地反映細(xì)胞所處的氧化還原狀態(tài)。

測(cè)定原理：

DTNB 與 GSH 反應(yīng)生成復(fù)合物，在 412nm 處有特征吸收峰；其吸光度與 GSH 含量成正比。

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體×1 瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 血清等液體：直接測(cè)定。

GSH 測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于 25℃（一般物種）或者 37℃（哺乳動(dòng)物）水浴中保溫 30min。

3. 空白管：取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 100μL 蒸餾水，700μL 試劑二，200μL 試劑三， 混勻靜置 2min 后測(cè)定 412 nm 吸光度 A1。

4. 測(cè)定管：取 1mL 玻璃比色皿，依次加入 100μL 上清液，700μL 試劑二，200μL 試劑三， 混勻靜置 2min 后測(cè)定 412 nm 吸光度 A2。

注意：空白管只需要測(cè)定一次。

GSH 含量計(jì)算公式：

GSH 標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y=1.5 x（x 為 GSH 濃度，μ mol /mL；y 為吸光值）

GSH 計(jì)算：

（1） 按蛋白濃度計(jì)算

GSH（μ mol/ mg prot）=(A2－A1) ÷1.5×V 樣÷（V 樣×Cpr ）=0.667×(A2－A1) ÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

GSH（μ mol/g 鮮重）=(A2－A1) ÷1.5×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W)=0.667×(A2－A1) ÷W

（3） 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

GSH（μ mol /104 cell）=(A2－A1) ÷1.5×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量)=0.667×(A2－A1) ÷細(xì)胞數(shù)量（4） 按液體體積計(jì)算

GSH（μ mol/ mL）=(A2－A1) ÷1.5×V 樣÷V 樣 =0.667×(A2－A1)

V 樣總：上清液總體積，1 mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μL=0.1 mL；W： 樣品質(zhì)量，g ；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；

注意事項(xiàng)：

1. 試劑一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測(cè)定。

2. 最低檢出限為 0.01mmol/L。