與常規(guī)PCR反應相比，實時熒光定量PCR（Real-time PCR）技術具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。

 

武漢英科生物技術有限公司技術人員根據(jù)熒光定量PCR原理在常規(guī)PCR基礎上加入相應的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。隨著PCR反應的進行，PCR反應產物逐漸增加，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖。

 

熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化。而在平臺期，擴增產物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，根據(jù)最終的 PCR 產物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段， PCR產物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值（如下圖所示）。

Ct 值：是指每個反應管內的熒光信號到達設定域值時所經歷的循環(huán)數(shù)。

 

研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值如下圖所示。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

 

 

PCR反應的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍，即：threshold = 10’SDcycle 6-15

 

 

研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù) Real-time PCR詳細介紹。

 

武漢英科生物技術有限公司開發(fā)的SYBR實時熒光定量PCR（Real-time PCR）檢測技術為國內首創(chuàng)，與國際品牌的公司開發(fā)的技術相比，具有檢測技術更靈敏，成本更低，實用性更強的優(yōu)勢。