諾如病毒GI型、GII型^RNA核酸檢測(cè)試劑盒（IAC，一管式PCR-熒光探針法）

◆ 產(chǎn)品說明

 諾如病毒GI型、GII型^RNA核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法）參照GB 4789.42-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 諾如病毒檢驗(yàn)》進(jìn)行設(shè)計(jì)，可于一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)GI型、GII型諾如病毒；適用于貝類生，食蔬菜，胡蘿卜、瓜、堅(jiān)果等硬質(zhì)表面食品，草莓、西紅柿、葡萄等軟質(zhì)水果等食品中GI型、GII型諾如病毒核酸的檢測(cè)。

◆ 產(chǎn)品組成（48測(cè)試）

012172MII
試劑	含量
A-GIGII	20μL× 7管×4排
IAC-Nor	20μL× 5管×4排
B-Nor	500μL × 1支
PG-Nor	100μL × 1支
NG-Nor	100μL × 1支

◆ 適用儀器

   ABI 系列、MJ 系列、Roche 系列、博日系列以及其它熒光定量PCR 檢測(cè)儀（可同時(shí)檢測(cè)FAM通道（494 nm）、VIC通道（538nm）兩種通道的熒光定量PCR儀）。

◆ 自備耗材和儀器

    ①冰盒；②移液器（1-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套滅菌吸頭（RNase free）；③離心機(jī)；④渦旋混勻器。

◆ 注意事項(xiàng)

1．本試劑檢測(cè)靈敏度高。為了防止污染，實(shí)驗(yàn)要分區(qū)操作。

   1）第一區(qū)：試劑準(zhǔn)備區(qū)。

   2）第二區(qū)：樣本制備區(qū)。

   3）第三區(qū)：擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)。

   ★ 分區(qū)之間最好進(jìn)行物理性隔離，避免人為因素造成的污染。

2. 實(shí)驗(yàn)過程中穿戴工作服和乳膠手套，使用移液器，試驗(yàn)產(chǎn)生的所有廢棄物及時(shí)處理。

3．嚴(yán)格按照操作步驟操作，試劑配制和加樣等步驟請(qǐng)嚴(yán)格按照說明書要求在冰上操作。

4．反應(yīng)液中的成分對(duì)光敏感，應(yīng)避光保存。試劑使用前剪下所需的測(cè)試數(shù)，解凍后使用前離心30秒。

5．反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增管請(qǐng)置于密封袋內(nèi)丟棄，當(dāng)日清理，開蓋易造成氣溶膠污染，禁止開蓋。

6．不同批號(hào)試劑請(qǐng)勿混合使用，在有效期內(nèi)使用。

◆ 試劑盒組分及樣品處理說明

（1）樣品前處理請(qǐng)參照GB 4789.42-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 諾如病毒檢驗(yàn)》進(jìn)行樣品前處理。

（2）A-GIGII為GI、GII反應(yīng)液，含有諾如病毒GIGII型引物探針。

（3）IAC-Nor為過程控制反應(yīng)液，含有過程控制病毒引物探針。

（4）B-Nor為提取過程控制液，進(jìn)行樣品RNA提取時(shí)請(qǐng)參照國(guó)標(biāo)法加入10 μL B-Nor作為提取過程控制；亦可參照國(guó)標(biāo)法另取50-100 μL B-Nor，用PBS緩沖液補(bǔ)足至200 μL，進(jìn)行核酸提取、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及計(jì)算提取效率。

（5）NG-Nor為陰性對(duì)照，也可參照國(guó)標(biāo)法提取陰性樣品核酸作為陰性對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

（6）PG-Nor含GI型、GII型諾如病毒核酸，可作為陽(yáng)性對(duì)照，亦可參照國(guó)標(biāo)法作為擴(kuò)增控制計(jì)算抑制指數(shù)。

*推薦使用我們公司的病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒中的方案進(jìn)行病毒RNA的提取，或者采用其他等效產(chǎn)品進(jìn)行RNA提取。

 

 

 

◆ 實(shí)驗(yàn)操作（推薦）

1. 反應(yīng)體系配制：（樣本制備區(qū)）

剪下所需測(cè)試數(shù)的已含有反應(yīng)液的PCR管，并參照下表進(jìn)行編號(hào)，放置在室溫待解凍后，離心30秒后揭開封口膜，使用穿刺加樣法穿過固封層向每管反應(yīng)液中分別加入模板。

孔編號(hào)	實(shí)驗(yàn)意義	反應(yīng)液	加入模板
A	空白對(duì)照	A-GIGII	5μL RNase free water
B	陰性對(duì)照	A-GIGII	5μL陰性對(duì)照
C	病毒提取過程控制1	IAC-Nor	5μL樣品RNA
D	病毒提取過程控制2	IAC-Nor	5μL過程控制病毒RNA
E	病毒提取過程控制3	IAC-Nor	5μL 101倍稀釋過程控制病毒RNA
F	病毒提取過程控制4	IAC-Nor	5μL 102倍稀釋過程控制病毒RNA
G	病毒提取過程控制5	IAC-Nor	5μL 103倍稀釋過程控制病毒RNA
H	擴(kuò)增控制1	A-GIGII	5μL樣品RNA+1μL擴(kuò)增控制RNA
I	擴(kuò)增控制2	A-GIGII	5μL 10倍稀釋樣品RNA+1μL擴(kuò)增控制RNA
J	擴(kuò)增控制3	A-GIGII	5μL RNase free water+1μL擴(kuò)增控制RNA
K	樣品1	A-GIGII	5μL樣品RNA
L	樣品2	A-GIGII	5μL 10倍稀釋樣品RNA

配制完成后請(qǐng)蓋上PCR管蓋，渦旋混勻并離心后上機(jī)反應(yīng)。

*請(qǐng)參照上表對(duì)管進(jìn)行編號(hào)，以免混淆。

2. 擴(kuò)增反應(yīng)（擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)）

使用熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，編號(hào)A～B，H～L使用FAM和VIC通道，編號(hào)C～G使用FAM通道。

按下列條件設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)：

PCR循環(huán)			熒光收集位點(diǎn)
50℃	10分鐘	1個(gè)循環(huán)	—
95℃	5分鐘	1個(gè)循環(huán)	—
95℃	10秒	45個(gè)循環(huán)	—
60℃	30秒		※

其他儀器請(qǐng)參照儀器說明書進(jìn)行設(shè)置。

◆ 結(jié)果判定

1. 實(shí)驗(yàn)有效性判定：

（1）實(shí)驗(yàn)滿足：空白對(duì)照陰性（A反應(yīng)孔)；陰性對(duì)照陰性（B反應(yīng)孔）；陽(yáng)性對(duì)照（J反應(yīng)孔）陽(yáng)性；否則本次實(shí)驗(yàn)無效，請(qǐng)與本公司技術(shù)支持聯(lián)系。

（2）過程控制（C~G反應(yīng)孔）需滿足：提取效率≥1%；如提取效率＜1%，需重新檢測(cè)；但如提取效率＜1%，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，也可酌情判定為陽(yáng)性。

（3）擴(kuò)增控制（H~J反應(yīng)孔）需滿足：抑制指數(shù)＜2.00；如抑制指數(shù)≥2.00，需比較10倍稀釋食品樣品的抑制指數(shù)；如 10 倍稀釋食品樣品擴(kuò)增的抑制指數(shù)＜2.00，則擴(kuò)增有效，且需采用10倍稀釋食品樣品RNA的Ct 值作為結(jié)果；10倍稀釋食品樣品擴(kuò)增的抑制指數(shù)也≥2.00時(shí)，擴(kuò)增可能無效，需要重新檢測(cè)；但如抑制指數(shù)≥2.00，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，也可酌情判定為陽(yáng)性。

2. 結(jié)果判定

待測(cè)樣品的Ct值大于等于45時(shí)，判定為諾如病毒陰性；待測(cè)樣品的Ct值小于等于38時(shí)，判定為諾如病毒陽(yáng)性；待測(cè)樣品的Ct值大于38，小于45時(shí)，應(yīng)重新檢測(cè)；重新檢測(cè)結(jié)果大于等于45時(shí)，判定為諾如病毒陰性；小于等于38時(shí)，判定為諾如病毒陽(yáng)性。