很多實驗小伙伴表示不知如何區(qū)分細胞凋亡和壞死，其實細胞凋亡與壞死是兩種完全不同的細胞凋亡形式，根據(jù)死亡細胞在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)上的差別，可以將二者區(qū)別開來。

細胞凋亡
是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主性、有序性的死亡，他涉及一系列基因的激活、表達以及調(diào)控等作用，具有生理性和選擇性的。

生理學(xué)意義

細胞凋亡對胚胎發(fā)育及形態(tài)發(fā)生、組織內(nèi)細胞群的穩(wěn)定、機體的防疫和免疫反應(yīng)、疾病或中毒時引起的細胞損傷和老化、腫瘤的發(fā)生進展起著重要作用，并且有著潛在的治療意義。

細胞壞死

是極端的物理、化學(xué)因素或嚴重的病理性刺激引起的細胞損傷和死亡，是非正常死亡。

長期以來細胞壞死被認為是因病理而產(chǎn)生的被動死亡，但是近期的研究表明，細胞壞死可能是細胞“程序性死亡”的另一種形式，具有包括引發(fā)炎癥反應(yīng)在內(nèi)的重要生理功能。當(dāng)細胞凋亡不能正常發(fā)生而細胞必須死亡時，壞死作為凋亡的“替補”方式被采用。

細胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹常用的形態(tài)學(xué)檢測方法。

1.光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

凋亡細胞的主要特征為核染色質(zhì)致密深染，形成致密質(zhì)塊，有時可碎裂。在HE染色的組織切片中細胞體積縮小，胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強，并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細胞常以分散單個形式存在，凋亡細胞與周圍細胞分離，不引起炎癥反應(yīng)。

本方法簡便易行，但在細胞密集的組織中對于改變不典型的細胞判斷較困難，常缺乏較為特征的指標，具有較強的主觀性，重復(fù)性差。本方法可用于調(diào)亡現(xiàn)象的初步觀察，作為分析指標之一。

1）未染色細胞：

凋亡細胞的體積變小、變形，全面皺縮，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體，凋亡小體為數(shù)個圓形小體圍繞在細胞周圍。貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。

2）染色細胞：

姬姆薩（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常細胞核色澤均一；凋亡細胞染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)；壞死細胞染色淺或沒染上顏色。   

蘇木素-伊紅（HE）染色：細胞核固縮碎裂、呈藍黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細胞），正常細胞核呈均勻淡藍色或藍色，壞死細胞核呈很淡的藍色或藍色消失。

2.熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜藖碓u判細胞凋亡的進展情況。 常用的DNA特異性染料有： Hoechst 33342， Hoechst 33258，DAPI。三種染料與DNA 的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍色熒光。 

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，能進入正常細胞膜而對細胞沒有太大細胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高。  DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細胞的染色。  

PI和Hoechst33342雙標：PI、Hoechst33342均可與細胞核DNA（或RNA）結(jié)合。但PI不能通過正常細胞膜，Hoechst則為膜通透性熒光染料，故細胞在處于壞死或晚期調(diào)亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色。

正常細胞和中早期調(diào)亡細胞均可被Hoechst著色，但是正常細胞核的Hoechst著色的形態(tài)呈圓形，淡蘭色，內(nèi)有較深的蘭色顆粒；而調(diào)亡細胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。故PI著色為壞死細胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為調(diào)亡細胞。  

凋亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。細胞凋亡過程中細胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

3.電子顯微鏡

雖然光學(xué)顯微鏡下可以看見胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體,但凋亡細胞的形態(tài)學(xué)變化大多發(fā)生在超微結(jié)構(gòu),因此用光鏡觀察難以令人滿意,而透射電鏡可清楚地觀察到細胞結(jié)構(gòu)在凋亡不同時期的變化。電鏡形態(tài)學(xué)觀察是迄今為止判斷凋亡最經(jīng)典、最可靠的方法,被認為是確定細胞凋亡的金標準。

檢測方法：

透射電鏡標本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色，透射電鏡觀察。掃描電鏡標本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級脫水，CO2臨界點干燥，真空噴金，掃描電鏡觀察。

結(jié)果評判: 

可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現(xiàn)象。

缺點：

1）只能定性,不能定量;

2）標本處理過程復(fù)雜,設(shè)備相對昂貴,對檢查者的技術(shù)水平要求較高,不適于大批標本檢測;

3）在組織切片上進行電鏡觀察時,有時凋亡很難與正常細胞有絲分裂相鑒別,因為兩種情況下都可出現(xiàn)染色質(zhì)濃聚。如同時進行熒光染色,可彌補電鏡檢查的不足。

質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

4.流式細胞技術(shù)

流式細胞儀檢測凋亡細胞是通過檢查其光射特征及熒光參數(shù)時行的。細胞穿過流式細胞儀的激光束集點時使激光發(fā)生散射，分析散射光可以提供細胞大小及結(jié)構(gòu)的信息。由于光散射牧場生并非凋亡細胞的特異性指標，細胞的機械性損傷和細胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測與熒光參數(shù)的檢測結(jié)合起來才能準確地辨認凋亡細胞。

細胞凋亡過程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解，導(dǎo)致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細胞熒光染色后作流式細胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細胞。

細胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果直觀,至今仍是判定細胞是否發(fā)生凋亡的金標準,但觀察凋亡細胞的形態(tài)特征耗時費力,不適于大量凋亡樣本的檢測。

對細胞培養(yǎng)有興趣或問題的朋友可以加入

“CellMax細胞培養(yǎng)交流群：515831066”

大家可以互相探討交流心得！

or

關(guān)注Cellmax服務(wù)號（公眾號）