本期我們重點講一下MesenPlify^TM無血清無異種成分人類間充質(zhì)干細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基的使用指南，本篇中主要講解的是原代MSC分離培養(yǎng)，具體以臍帶組織塊法分離原代MSC操作為例。

原代MSC分離培養(yǎng)

步驟一 準(zhǔn)備材料

● 培養(yǎng)基：新鮮配置的MesenPlify^TM sXF完全培養(yǎng)基（加1%雙抗）。

● 培養(yǎng)皿：準(zhǔn)備多個15cm皿進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

● 消毒劑：醫(yī)用消毒酒精（75%）。

● 洗滌液：生理鹽水（無菌，加 1%雙抗）。

● 工具盒：包括剪刀、鑷子、手術(shù)刀、移液器、離心管（50mL）等。

● 臍帶樣本：新鮮的臍帶泡在含有1%雙抗的PBS里4℃保存運輸（最好在獲得后盡快處理）。

步驟二 消毒處理

01  吸棄臍帶保存液。

02  使用75%的醫(yī)用消毒酒精完全浸沒臍帶，浸泡2分鐘以確保消毒效果。

步驟三 清洗臍帶

01  用無菌生理鹽水清洗臍帶2-3次，確保徹底去除殘留的臍血。

02  每次清洗后均應(yīng)用無菌的工具保持臍帶在無菌環(huán)境中。

步驟四 剪切處理

01  將臍帶剪成約2-3cm的小段。

02  用無菌生理鹽水再清洗2-3次，確保去除殘留的臍血。

步驟五 分離華通氏膠

01  沿靜脈剪開臍帶，盡量去除2條靜脈壁與1條動脈壁。

02  輕輕分離華通氏膠，注意避免損傷表皮，使用彎頭手術(shù)剪將華通氏膠至2-3mm³大小的組織方塊，膠質(zhì)面向下，平鋪在150mm細(xì)胞培養(yǎng)皿上，每皿10-12片方塊。

步驟六 細(xì)胞培養(yǎng)

01  由組織塊正上方緩慢滴加37℃復(fù)溫的MesenPlify^TM sXF完全培養(yǎng)基，每個皿滴加15mL左右，注意不要讓組織塊飄起來。

02  放入37°C、5%CO₂和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

步驟七 換液（注意：每2-3天換液一次）

01  每日觀察是否有細(xì)胞從組織塊爬出。

02  換液時，將培養(yǎng)瓶傾斜，同時避免組織塊滑動，小心吸棄上清液。

03  慢慢加入37℃復(fù)溫的MesenPlify^TM sXF完全培養(yǎng)基，滴加培養(yǎng)基的手法與上述相同。

04  將細(xì)胞培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

05  正常換液培養(yǎng)，直到觀察到組織塊周圍有梭形細(xì)胞爬出時，使用滅菌后的鑷子夾除組織塊，此時如果再次換液，MesenPlify^TM sXF完全培養(yǎng)基的用量可改為為18-20mL/皿。

步驟八 傳代 （注意：在接種后第 12 天左右 ）

01  觀察細(xì)胞的生長狀況，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到約80%時，可進(jìn)行消化傳代。

02  傳代時細(xì)胞的接種密度為6000/cm²，請依據(jù)所需的細(xì)胞量，選擇合適大小的細(xì)胞培養(yǎng)皿。（具體操作步驟可參考下期“hMSCs的傳代培養(yǎng)”

注意事項：

所有操作都應(yīng)在無菌條件下進(jìn)行，避免任何非無菌材料的接觸。

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