本期主要內容是分享冷凍保存后的hMSCs的如何復蘇，hMSCs的傳代培養(yǎng)具體的操作流程，成功復蘇后操作傳代培養(yǎng)，將hMSCs適應到MesenPlify^TM sXF培養(yǎng)基，獲得最終實驗數(shù)據(jù)。

hMSCs復蘇傳代培養(yǎng)操作過程

冷凍保存的hMSCs的復蘇

1、將MesenPlifyTM sXF完全培養(yǎng)基提前恢復至室溫或37°C。

2、將hMSCs凍存管放置在37°C的水浴中迅速解凍，直到觀察到剩余的少量冰晶即將消失。

3、將凍存管內的細胞懸液轉移到一個15或50mL錐形管中，緩慢地滴加10mL MesenPlifyTM sXF完全培養(yǎng)基，輕柔混勻。

4、以300xg的速度在室溫下離心5分鐘收集細胞。 5、棄去上清液以去除二甲基亞砜(DMSO)保護劑。 

6、用1mL MesenPlifyTM sXF完全培養(yǎng)基重新懸浮細胞。 

7、進行細胞計數(shù)。

（注意：如果細胞密度超過細胞計數(shù)器的推薦范圍，可能需要在培養(yǎng)基中進一步稀釋樣品。） 

8、按照較高的接種密度（5,000-7,000/cm2）將細胞接種到細胞培養(yǎng)容器中，使用MesenPlifyTM sXF完全培養(yǎng)基補充至適當體積。

（TIPS：當細胞剛從凍存中復蘇時，建議使用高的接種密度） 

9、在37°C、5% CO₂和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。

10、每隔3-4天使用預熱至37°C的MesenPlifyTM sXF完全培養(yǎng)基進行換液，或傳代（當細胞匯合度達到70-80%時，具體操作步驟可參考下文“hMSCs的傳代培養(yǎng)”）。

hMSCs的傳代培養(yǎng)

1、檢查hMSCs是否達到70-80%的匯合度。注意不要讓hMSCs達到100%的匯合度，否則細胞可能會出現(xiàn)分化的跡象。

2、將MesenPlifyTM sXF完全培養(yǎng)基提前恢復至室溫或37°C。

3、用10mL的不含Ca++、不含Mg++的DPBS（不包含在套裝中）輕輕洗滌細胞一次。

4、添加復溫的0.125%胰蛋白酶消化液（稀釋為0.5x使用）或重組胰蛋白酶消化液TrypLE（1×）（不包含在套裝中），以覆蓋整個組織培養(yǎng)瓶的表面。

5、輕輕旋轉培養(yǎng)瓶，使胰蛋白酶均勻分布在表面上。

6、放在37°C培養(yǎng)箱中2-7分鐘。 （TIPS：初次使用 MesenPlifyTM sXF完全培養(yǎng)基應摸索合適的消化時間，若細胞剛從FBS培養(yǎng)基中轉過來，可能需要5-7分鐘。若細胞已完全適應無血清培養(yǎng)，消化時間可能縮短至2-4分鐘。 細胞在無血清培養(yǎng)基中較容易消化脫落，此為正常現(xiàn)象，應注意避免消化過度的情況發(fā)生，推薦使用重組胰蛋白酶消化液 TrypLE（1×），若采用胰蛋白酶消化液，可稀釋到 0.125%（0.5x）使用）。

7、使用相差顯微鏡檢查細胞是否已脫落，輕輕敲擊培養(yǎng)瓶的側面以幫助脫落。 

8、一旦細胞脫落并自由漂浮，將MesenPlifyTM sXF完全培養(yǎng)基添加到消化液體積的3倍，以終止消化。

9、將細胞懸液收集到一個50mL錐形管中。

10、以300xg的速度在室溫下離心5分鐘。 

11、棄去上清液以去除胰蛋白酶。 

12、用1mL MesenPlifyTM sXF完全培養(yǎng)基重新懸浮細胞。

13、進行細胞計數(shù)。（TIPS：如果細胞密度超過細胞計數(shù)器的推薦范圍，可能需要在培養(yǎng)基中進一步稀釋樣品。）

14、計算所需的培養(yǎng)基體積，根據(jù)實驗需要或視細胞狀態(tài)，以常規(guī)的接種密度（3000-5000/cm2）或較高接種密度（5000-7000/cm2）將細胞接種到新的細胞培養(yǎng)器皿中。

15、使用MesenPlifyTM sXF完全培養(yǎng)基補充至適當體積（可參考下表）。 

16、在37°C、5% CO₂和飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞。 

17、每隔3-4天使用預熱至37°C的MesenPlifyTM sXF完全培養(yǎng)基進行換液，或傳代（當細胞匯合度達到70-80%時）。

hMSC傳代和培養(yǎng)操作推薦用量: 

hMSCs的冷凍保存

1、通過添加20%二甲基亞砜（DMSO，套裝中未提供）制備2x的冷凍保存液。

（TIPS：假設最終需要的細胞凍存體積為1mL，先準備500uL的2x冷凍保存液，配制方法是將100uL的100% DMSO加入到400uL的MesenPlifyTM sXF完全培養(yǎng)基中）

2、將細胞復溫至室溫的MesenPlifyTM sXF完全培養(yǎng)基中懸浮，使細胞的濃度為常規(guī)細胞濃度的兩倍（例如2x106/mL）。

3、將步驟1中制備的2x冷凍保存液，以1:1的體積，緩慢地滴加到細胞懸浮液中，然后用移液管輕輕混合。（此時，冷凍液的濃度被稀釋為1x，即DMSO的最終濃度為10%，細胞濃度為1x106/mL）

4、將混合好的細胞懸液，轉移到預冷到2- 8°C的細胞凍存管中。

5、轉入梯度降溫盒，-80℃過夜，隔天轉入液氮長期保存。

（TIPS：也可以購買其他商品化的hMSCs冷凍保存液進行凍存，操作步驟參見其說明書進行） 

hMSC的特性分析

可以使用流式細胞術、集落形成單位（CFU）分析以及多向分化分析對培養(yǎng)的hMSCs進行特性分析。 詳情請參考指南手冊獲取信息(Guide Book: Human Mesenchymal Stem Cells)。

將hMSC適應到MesenPlify^TM sXF培養(yǎng)基的過程

如果正在使用其他品牌培養(yǎng)基，可以直接切換到MesenPlify^TM sXF體系，一般情況下無需進行預處理。當細胞剛從凍存中復蘇時，也可先用原培養(yǎng)基進行復蘇，隨后在Day1更換為MesenPlify^TM sXF完全培養(yǎng)基，后續(xù)即可正常使用MesenPlify^TM sXF完全培養(yǎng)基培養(yǎng)或傳代。

將hMSC適應到MesenPlify^TM sXF培養(yǎng)基的過程

僅供研究使用（RUO），或用于進一步制造。 

不適用于人類或動物診斷或治療用途。 

產品按照ISO 13408和ISO 9001相關的質量管理體系進行制造。

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