細(xì)胞生物膜所含的蛋白稱為膜蛋白，其參與和行使了眾多細(xì)胞功能，包括細(xì)胞與外界進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸、信息傳遞、能量交換等。膜蛋白擔(dān)任了各種神經(jīng)信號(hào)分子、激素和其他底物的受體，構(gòu)成了各種離子跨膜的通道，以及構(gòu)成各類轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在人體蛋白中，有大約 30% 是膜蛋白。FDA 批準(zhǔn)的新藥中，絕大多數(shù)都以膜蛋白為靶點(diǎn)。

隨著對(duì)膜蛋白工作機(jī)理的深入研究，新的細(xì)胞調(diào)控作用靶點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn)，從而使作用于靶點(diǎn)的新藥能更有針對(duì)性地被開(kāi)發(fā)出。例如現(xiàn)在市面上有不少基于細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白設(shè)計(jì)的藥物，最常見(jiàn)一類抗高血壓藥（如氨氯地平），其主要功能是鈣離子通道阻滯劑，選擇性的同離子通道結(jié)合以阻滯鈣離子進(jìn)入細(xì)胞，從而導(dǎo)致心肌收縮力減弱、心率減慢和血管擴(kuò)張等以達(dá)到降壓的作用。膜蛋白結(jié)構(gòu)是設(shè)計(jì)并開(kāi)發(fā)靶向作用于膜蛋白藥物的重要依據(jù)，但目前已被研究清楚結(jié)構(gòu)的膜蛋白僅占膜蛋白總量的 1%。這是因?yàn)槟さ鞍滓栏交驒M跨在細(xì)胞膜的磷脂雙分子層上，所以膜蛋白的純化、結(jié)構(gòu)的解析等都極具挑戰(zhàn)性。 

對(duì)蛋白包括膜蛋白結(jié)構(gòu)的解析和研究是蛋白研究的基礎(chǔ)， X 射線晶體學(xué)、核磁共振（NMR）和冷凍電鏡（Cryo-EM）被稱作結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的三大利器，在現(xiàn)今已解析的膜蛋白結(jié)構(gòu)中，90% 以上都采用的是 X 射線晶體學(xué)方法，而核磁共振在小分子量的蛋白結(jié)構(gòu)解析中發(fā)揮了重要的作用。數(shù)十年里，X-射線晶體學(xué)一直是解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的首選方法。然而 X 射線晶體學(xué)方法對(duì)樣品要求很高，需要得到具有衍射能力的蛋白晶體。但許多的蛋白質(zhì)，尤其是膜蛋白和蛋白質(zhì)復(fù)合物卻難以結(jié)晶。而另一方面，NMR 可用來(lái)解析較小的蛋白的結(jié)構(gòu)（一般不超過(guò) 30 kDa），但較難用于分子量較大蛋白的結(jié)構(gòu)解析。在之前的很長(zhǎng)時(shí)間里，冷凍電鏡由于其解析結(jié)構(gòu)的分辨率較低，一直未能得到廣泛的應(yīng)用。近年來(lái)，冷凍電鏡領(lǐng)域里硬件和算法的突破性進(jìn)展使得現(xiàn)在能夠利用 cryo-EM 解析近原子分辨率的結(jié)構(gòu)，及大地促進(jìn)了結(jié)構(gòu)生物學(xué)的發(fā)展。

不同于晶體學(xué)，cryo-EM 所需的樣品量很少、無(wú)需生成晶體而只需保持水溶液環(huán)境下穩(wěn)定。在 2013 年末，美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校的程亦凡教授與同事 David Julius 合作，利用單電子計(jì)數(shù)探測(cè)器，以近原子分辨率 (3.4 Å)，確定了在疼痛和熱知覺(jué)中起中心作用的一種膜蛋白 TRPV1 的結(jié)構(gòu)。這一研究成果讓相關(guān)領(lǐng)域工作者開(kāi)始重新審視冷凍電鏡在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的所能發(fā)揮的作用。這對(duì)于一些難結(jié)晶的蛋白質(zhì)，特別是膜蛋白的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究提供新的契機(jī)。隨著不斷的嘗試，利用冷凍電鏡對(duì)膜蛋白結(jié)構(gòu)解析的成果也越來(lái)越多，作為藥物研發(fā)方面的應(yīng)用，要分析小分子與蛋白質(zhì)的互作，而且分辨率越高越好�，F(xiàn)在 Subramaniam 等人達(dá)到了 cryo-EM 成像迄今為止的最高分辨率（2.2 Å），此前只有 X 射線晶體衍射達(dá)到過(guò)這種水平的分辨率，這能為人們提供足夠的結(jié)構(gòu)信息，進(jìn)行更好的藥物研發(fā)。
 

圖 1：分辨率對(duì)觀測(cè)結(jié)果的影響（左）不同分辨率對(duì)應(yīng)能測(cè)定的分子結(jié)構(gòu)（右）
（圖片來(lái)源：Elad Binshtein, Melanie D. Biochemistry, 2015）

膜蛋白基本可分為三大類：整合膜蛋白、外周膜蛋白和脂錨定蛋白。整合膜蛋白占膜蛋白種類的 70%～80%。外周膜蛋白一般為水溶性，相對(duì)容易分離和純化，也較易獲得結(jié)晶供 X 射線衍射分析。難于研究的是整合膜蛋白，由于其具有疏水的跨膜區(qū)域，因此直接暴露在水溶液環(huán)境下非常不穩(wěn)定，因此需要添加去污劑進(jìn)行穩(wěn)定。而當(dāng)用去污劑保護(hù)膜蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析和功能研究時(shí)，又會(huì)因?yàn)槟さ鞍纂x開(kāi)其天然磷脂雙分子而丟失有關(guān)脂質(zhì)互作及它們對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)影響這一層重要信息。這尤其對(duì)需要脂質(zhì)起結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)有較大影響。另外，不合適的去污劑會(huì)使膜蛋白不穩(wěn)定，且去污劑膠束與磷脂分子的結(jié)構(gòu)差異及水脂界面彎曲度在某些情況下可能造成膜蛋白結(jié)構(gòu)的改變。

為了更好地讓膜蛋白能夠穩(wěn)定在水溶液環(huán)境下通過(guò)冷凍電鏡進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，且避免去污劑會(huì)帶來(lái)的潛在影響，作為模擬細(xì)胞膜磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的 Nanodisc 是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受各種不確定因素影響的解決方案。Nanodisc 最早由 UIUC 的 Stephen Sligar 教授提出，其由膜支架蛋白 (membrane scaffold proteins, MSPs) 和磷脂分子構(gòu)成的磷脂雙分子層類膜結(jié)構(gòu)。Nanodisc 的理化性質(zhì)與細(xì)胞膜磷脂雙分子層相似，且膜蛋白可以整合到 Nanodisc 中，最大限度地保持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和生物學(xué)活性，為膜蛋白的研究提供了有力的技術(shù)支持。膜支架蛋白（MSPs） 是載脂蛋白（apo）A-I 的縮減版，它們包繞著脂質(zhì)雙分子層從而形成圓盤(pán)狀的結(jié)構(gòu)，即 Nanodisc。其包含一個(gè)朝向內(nèi)部脂層的疏水面和朝外的親水面。這一結(jié)構(gòu)使得 Nanodisc 在水溶液中具有很高的溶解度，同時(shí)具有非常高的穩(wěn)定性。通過(guò) Nanodisc 包裹，純化后的膜蛋白在保持空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和活性的同時(shí)，也將模擬膜蛋白原有在細(xì)胞膜上的狀態(tài)，跨膜域被包埋在磷脂雙分子層內(nèi)部。
 

 
圖 2：膜蛋白組裝到 Nanodiscs 的原理圖。
綠色：膜支架蛋白（MSPs）；灰色：磷脂；橙色：膜蛋白
（圖片來(lái)源 Cube Biotech 官方網(wǎng)站）

將膜蛋白組裝到 Nanodiscs 中主要有兩種方法。
 

• 第一：組裝溶解在去污劑中的膜蛋白在去污劑存在條件下將膜蛋白純化，然后再添加 MSPs 和磷脂。含有膜蛋白的 Nanodiscs 能夠自發(fā)地組裝，在去除掉表面活性劑后可以通過(guò)凝膠過(guò)濾（排阻層析）等方式來(lái)純化。
• 第二：Nanodiscs 與無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系相結(jié)合，針對(duì)于一些特殊蛋白，例如帶有毒性的蛋白可通過(guò)無(wú)細(xì)胞表達(dá)體系表達(dá)，通過(guò)加入已經(jīng)預(yù)先組裝的 Nanodiscs 使表達(dá)出的膜蛋白通過(guò)自組裝鑲嵌進(jìn)去。

圖 3：膜蛋白與 Nanodisc 的兩種組裝機(jī)制
（圖片來(lái)源 Cube Biotech 官方網(wǎng)站）

左圖：膜蛋白（橙色）溶解在去污劑（深灰色）中并與凍干的 MSP（綠色）和磷脂（淺灰）混合。然后去除去污劑，形成蛋白-Nanodisc 復(fù)合物。
右圖：預(yù)組裝了 MSP 與磷脂的 Nanodisc 加入到無(wú)細(xì)胞反應(yīng)液（cell-free expression systems）中，新生的膜蛋白能夠自發(fā)地組裝到 Nanodisc 中。

結(jié)合 Nanodisc 和冷凍電鏡這兩項(xiàng)技術(shù)，越來(lái)越多的膜蛋白結(jié)構(gòu)得以解析。其中較有代表性的包括程亦凡教授通過(guò)闡明 Nanodisc 中 TRPA1 的結(jié)構(gòu)揭示了配體和脂質(zhì)的作用機(jī)制，確定了環(huán)狀脂質(zhì)和調(diào)節(jié)脂質(zhì)的定位，證實(shí)通過(guò)形成一種三元復(fù)合物，特異的磷脂互作促進(jìn)了一種蜘蛛毒素等相關(guān)配體結(jié)合 TRPV1，相關(guān)成果發(fā)表在 2016 年 Nature 上。 此外由于 Nanodisc 還可以實(shí)現(xiàn)在同一個(gè) Nanodisc 上實(shí)現(xiàn)寡聚、二聚和單體的鑲嵌，來(lái)自歐洲的 Rouslan G 及其合作者在 Nanodisc 上鑲嵌 ryanodine 受體四聚體使用冷凍電鏡實(shí)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)解析，相關(guān)成果也發(fā)表在 2015 年 Nature 雜志上。相信伴隨著冷凍電鏡解析能力的不斷提升，以及如 Nanodisc 穩(wěn)定膜蛋白和還原膜蛋白天然環(huán)境技術(shù)的不斷出現(xiàn)，膜蛋白結(jié)構(gòu)解析和功能研究將會(huì)迎來(lái)全新的發(fā)展。
 

 
圖 4：通過(guò)冷凍電鏡解析 Nanodisc 包裹 TRPA1 蛋白結(jié)構(gòu)，b、c 灰色部分為 Nanodisc
（圖片來(lái)源于程亦凡 2016 Nature 文章）

 
圖 5：通過(guò)冷凍電鏡解析 Nanodis 包裹 ryanodine 受體四聚體結(jié)構(gòu)，灰色部分為 Nanodisc
（圖片來(lái)源于 Rouslan G 2015 Nature 文章）

參考：

1.    Yifan Cheng , et al. A Primer to Single-ParticleCryo-Electron Microscopy. 161(3):438 (2015).
2.    Elad Binshtein, Melanie D. Ohi Cryo-Electron Microscopy and theAmazing Race to Atomic Resolution [J]. Biochemistry, 54: 3133-3141（2015）.
3.    Yifan Cheng , et al. Single-particle electron cryomicroscopy. Nature Methods 11, 30 (2014). 
4.    Li, X. et al. Electron counting and beam-induced motion correction enablenear-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nature Methods 10, 584–590(2013)
5.    Bayburt, T.H., Grinkova, Y.V. & Sligar, S.G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Lett. 2, 853–856 (2002).
6.    Bartesaghi A, Merk A, Banerjee S, Matthies D, Wu X, Milne JL, Subramaniam S. Electron microscopy. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 5;348(6239):1147-51 (2015).
7.    Sun L, Zhang X, Gao S, Rao PA, Padilla-Sanchez V, Chen Z, Sun S, Xiang Y, Subramaniam S, Rao VB, Rossmann MG. Cryo-EM structure of the bacteriophage T4 portal protein assembly at near-atomic resolution. Nat Commun. 6;6:7548 (2015).
8.    Ilia G Denisov，Sligar, S.G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structural & Molecular Biology23,481–486(2016)
9.    Rouslan G. E, et al. Architecture and conformational switchmechanism of the ryanodine receptor. Nature 517. 39 (2015). 
10.    Lagers tröm, M.C. et al. Structural diversity of Gprotein-coupled receptors and significance for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery 7, 339-357 (2008).
11.    .Hagn, F. et al. Optimized phospholipid bilayer Nanodiscs facilitate high-resolution structure determination of membrane proteins. J.Am.Chem. Soc., 135:1919-1925(2013).
12.    Wang, Z. et al. Tyrosine phosphorylation of Mig6 reduces its inhibition of the epidermal growth factor receptor. ACS Chem. Biol. 8(11):2372-6, (2013).
13.    Timothy H. B, et al. Transducin Activation by Nanoscale Lipid Bilayers ContainingOne and Two Rhodopsins. JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY. 282 (2007).
14.    Krueger-K, et al. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane Proteion. J Biomol NMR, 28(1) 43-57 (2004).
15.    Yoshiura C, et al. NMR analyses of the interaction between CCR5 and its ligand using functionalreconstitution of CCR5 in lipid bilayers. J Am Chem Soc, 132 (19): 6 768-6 777 (2010).
16.    Erik Henrich, et al. Analyzing native membrane proteinassembly in nanodiscs by combined noncovalent mass spectrometry and syntheticbiology. eLife6:e20954 (2017).
17.    Moers et al., Modified lipid and protein dynamics in Nanodiscs. Biochim. Biophys. Acta, 1828(4):1222-9, (2013). 
18.    Nasr. et al., Radioligand binding to Nanodisc-reconstituted membrane transporters assessed by the scintillation proximity assay. Biochemistry, 14;53(1):4-6, (2014).
19.    畢允晨，王玉娟，王俊峰. Nanodisc 體系在膜蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究中的應(yīng)用。《波譜學(xué)雜志》, 28(2):177-189（2011）
20.    張凱. 什么是 2015 年最受科學(xué)界關(guān)注的新技術(shù)？知乎專欄，(2016)
21.    程亦凡博士 Nature 發(fā)表突破性成果. 生物通，(2016)
22.    Nature Methods 公布 2015 年度技術(shù). 生物通，(2016)