英國(guó)TwistDx公司(前身為ASM科技有限公司)成立于1999年，基于英國(guó)劍橋Babraham研究院建立的生物技術(shù)公司。該公司通過(guò)突破等溫DNA擴(kuò)增，開(kāi)發(fā)的重組酶聚合酶擴(kuò)增專利技術(shù)(RPA),被譽(yù)為DNA診斷領(lǐng)域的革命性創(chuàng)新。(http://.uk)                   

　　What is RPA?

　　概念：重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，被稱為是可以替代PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)。RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應(yīng)溫度在37°C左右。

　　RPA技術(shù)原理：

　　重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動(dòng)DNA合成，對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個(gè)體系中，由兩個(gè)相對(duì)的引物起始一個(gè)合成事件。整個(gè)過(guò)程進(jìn)行得非常快，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物。

　　Who uses RPA?

　　以此為基礎(chǔ)的TwistAmp® 核酸擴(kuò)增產(chǎn)品，能夠在15分鐘內(nèi)進(jìn)行常溫下的單分子核酸檢測(cè)該技術(shù)對(duì)硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

RPA技術(shù)有哪些特性:

RPA的特性：

快速檢測(cè) 15min進(jìn)行單分子檢測(cè)試驗(yàn)

簡(jiǎn)易包裝 穩(wěn)定凍干形式試劑

無(wú)需熱循環(huán)過(guò)程 擺脫任何儀器束縛

便攜 設(shè)備要求低，貧瘠條件亦能 完成檢測(cè)

RPA能實(shí)現(xiàn)多重化嗎

可以。RPA技術(shù)支持在同一個(gè)管中同時(shí)進(jìn)行多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)。不過(guò)，多重化的引物組合需要精心設(shè)計(jì)，以便每個(gè)引物都能同樣有效的工作。需要注意的是，RPA反應(yīng)的引物總量(nmol)最好不要超標(biāo)太多。如果在一個(gè)反應(yīng)中使用兩個(gè)以上的擴(kuò)增引物，就應(yīng)該控制不同引物的量。另外，我們應(yīng)當(dāng)事先考慮好檢測(cè)多個(gè)擴(kuò)增事件的探針、設(shè)備以及熒光團(tuán)的兼容性。

能否對(duì)模板進(jìn)行定量

可以。擴(kuò)增子達(dá)到可檢出水平的時(shí)間，依賴于反應(yīng)起始時(shí)的模板量。初始模板的拷貝越多，擴(kuò)增子就越快達(dá)到可檢出水平。不過(guò)，這種定量需要精心的實(shí)驗(yàn)安排，確保對(duì)照反應(yīng)是同時(shí)開(kāi)始的。舉例來(lái)說(shuō)，可以利用鎂離子的添加時(shí)間進(jìn)行控制。因?yàn)殒V離子一旦進(jìn)入體系，RPA反應(yīng)就會(huì)開(kāi)始。

此外，較慢的擴(kuò)增過(guò)程有助于更精確的定量。我們可以通過(guò)調(diào)整反應(yīng)條件或引物設(shè)計(jì)來(lái)減慢RPA的反應(yīng)速度。

能否進(jìn)行熒光終點(diǎn)分析

可以。這樣比較的是反應(yīng)開(kāi)始時(shí)的熒光和反應(yīng)結(jié)束時(shí)的熒光，熒光增強(qiáng)意味著發(fā)生了擴(kuò)增。

能否支持生物素或熒光標(biāo)記的寡核苷酸

支持。在RPA反應(yīng)中，連有生物素或熒光團(tuán)的引物與未修飾的引物表現(xiàn)差不多。據(jù)悉還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何差異。

跑膠前需要回收RPA產(chǎn)物嗎

需要。RPA反應(yīng)中的物質(zhì)會(huì)干擾瓊脂糖電泳，如果不進(jìn)行產(chǎn)物回收，跑出來(lái)的帶會(huì)出現(xiàn)拖尾。

恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

取代PCR的核酸擴(kuò)增術(shù)

領(lǐng)域：廣泛應(yīng)用于臨床診斷，食品安全檢測(cè)，動(dòng)物疾病檢測(cè)等領(lǐng)域

特點(diǎn)：快速，高效，特異，無(wú)需專門(mén)設(shè)備

RPA與LAMP對(duì)比

LAMP:環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法的特征是針對(duì)目標(biāo)DNA鏈上的六個(gè)區(qū)段設(shè)計(jì)四個(gè)不同的引物然后再利用鏈置換反應(yīng)在一定溫度下進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)只需要把基因模板、引物、鏈置換型DNA合成酶、基質(zhì)等共同置于一定溫度下(60～65℃)、經(jīng)一個(gè)步驟即可完成。

RPA：主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。

重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動(dòng)DNA合成，對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個(gè)體系中，由兩個(gè)相對(duì)的引物起始一個(gè)合成事件。

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