人膠原酶II（Collagenase II）ELISA試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用      標本：血清或血漿

樊克生物供應(yīng)

使用目的：本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關(guān)液體樣本膠原酶II（Collagenase II）含量。

試驗原理：

Collagenase II試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）.已知Collagenase II濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內(nèi)進行檢測。先將Collagenase II和生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中Collagenase II的濃度呈比例關(guān)系。

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試劑盒內(nèi)容及其配制

試劑盒成份（2-8℃保存）	96孔配置	48孔配置	配制
96/48人份酶標板	1塊板（96T）	半塊板（48T）	即用型
塑料膜板蓋	1塊	半塊	即用型
標準品：80ng/ml	1瓶（0.6ml）	1瓶（0.3ml）	按說明書進行稀稀
空白對照	1瓶（1.0ml）	1瓶（0.5ml）	即用型
標準品稀釋緩沖液	1瓶（5ml）	1瓶（2.5ml）	即用型
生物素標記的抗Collagenase II抗體	1瓶（6ml）	1瓶（3.0ml）	即用型
親和鏈酶素-HRP	1瓶（10ml）	1瓶（5.0ml）	即用型
洗滌緩沖液	1瓶（20ml）	1瓶（10ml）	按說明書進行稀釋
底物A	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）	即用型
底物B	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）	即用型
終止液	1瓶（6.0ml）	1瓶（3.0ml）	即用型
標本稀釋液	1瓶（12ml）	1瓶（6.0ml）	即用型

自備材料

1．  蒸餾水。

2．  加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

3．  振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性

1．  避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請盡快用水沖洗。

2．  實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

3．  不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。

操作注意事項

1．  試劑應(yīng)按標簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標準品應(yīng)丟棄，不可保存。

2．  實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

3．  不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

4．  使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

5．  使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

6．  洗滌酶標板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應(yīng)孔中吸水。

7．  底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。

8．  加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。

9．  按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

樣品收集、處理及保存方法

1、  血清－－－－-操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2、  血漿－－－－-EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、  細胞上清液－－-1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4、  組織勻漿－－－－-將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液

5、  保存－－－－－－如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

【膠原酶II（Collagenase II）ELISA試劑盒】試劑的準備

1．  標準品：標準品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準備，不能儲存。稀釋前將標準品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進行：

80 ng/ml	（6號標準品）	原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。
40 ng/ml	（5號標準品）	100ul的原倍標準品加入100ul的標準品稀釋液
20 ng/ml	（4號標準品）	100ul的5號標準品加入100ul的標準品稀釋液
10 ng/ml	（3號標準品）	100ul的4號標準品加入100ul的標準品稀釋液
5.0 ng/ml	（2號標準品）	100ul的3號標準品加入100ul的標準品稀釋液
2.5 ng/ml	（1號標準品）	100ul的2號標準品加入100ul的標準品稀釋液
0 ng/ml	（空白對照）	原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2．  洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。

操作步驟

1．  使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。

2．  根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標準品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標本用標本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。

3．  加入稀釋好后的標準品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時。

4．  甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

5．  每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6．  甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

7．  每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。

8．  取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。

9．  在450nm波長處測定各孔的OD值。

建議使用的實驗方案

標準品濃度（ng/ml）

A

80

80

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

B

40

40

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

C

20

20

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

D

10

10

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

E

5.0

5.0

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

F

2.5

2.5

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

G

0

0

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

H

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

局限

6號標準品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標準曲線無法得到精確的結(jié)果。

膠原酶II（Collagenase II）ELISA試劑盒性能

1. 靈敏度：最小的檢測濃度小于1號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。

2. 特異性：不與其它細胞因子反應(yīng)。

3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

結(jié)果判斷與分析

1、儀器值：于波長450nm的酶標儀上讀取各孔的OD值

2、以吸光度OD值為縱坐標（Y），相應(yīng)的Collagenase II標準品濃度為橫坐標（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的Collagenase II含量可根據(jù)其OD值由標準曲線換算出相應(yīng)的濃度。

3、檢測值范圍：0-80ng/ml

4、敏感度： 0.1 ng/ml

上海樊克生物專業(yè)生產(chǎn)供應(yīng)的試劑盒類產(chǎn)品有：雙抗夾心ELISA檢測、ELISA試劑盒、人ELISA試劑盒、酶聯(lián)檢測試劑盒、國產(chǎn)進口試劑、代測elisa試劑盒、ELISA檢測試劑盒、大鼠ELISA試劑盒、小鼠ELISA試劑盒、凋亡相關(guān)因子試劑盒、白介素ELISA試劑盒、VIP ELISA kit等實驗室產(chǎn)品，產(chǎn)品品質(zhì)，質(zhì)量保證。

The performance of kit:

1 sensitivity: minimum detection concentration is less than 1 standard. LiCollagenase IIarity of dilution. Sample liCollagenase IIar regression and the expected concentration correlation coefficient R value is 0.990.

2: no specific reaction with other cytokiCollagenase IIs.

3 repeaCollagenase IIility: plate, plate between the coefficients of variation were less than 10%.

Human type III procollagen amino terminal peptide ELISA kit steps:

1 before use, all reagents and mixing. Do not allow liquid to produce a large number of bubbles, so as to avoid adding a large number of bubbles, resulting in the addition of the error.

2 according to determiCollagenase II the number of sample number plus standard strip number. Each standard and blank hole is recommended to do the hole. Each sample can be made according to its own quantity, and can be used as a hole in the hole.

3 diluted after standard 50ul in reaction hole, added to the sample 50 UL in reaction hole to be measured. Immediately joiCollagenase IId the 50 UL antibody biotin. Cover the membraCollagenase II plate, gently oscillating mixing, 37 degrees Celsius for 45 minutes.

4 left hole liquid, each hole filled with washing liquid, oscillating 30 seconds off the washing liquid, pat dry with absorbent paper. Repeat this operation 4 times. If the washing machiCollagenase II with washing, washing times increased once.

5 per hole adding chain affinity enzyme -HRP 100ul, gently oscillating mixing, 37 degrees 30 minutes incubation.

6 left hole liquid, each hole filled with washing liquid, oscillating 30 seconds off the washing liquid, pat dry with absorbent paper. Repeat this operation 4 times. If the washing machiCollagenase II with washing, washing times increased once.

7 per hole adding substrate A, B 50ul, gently oscillating mixing, 37 degrees 5 minutes incubation. Avoid light.

8 remove ELISA plate, quickly add 50ul terminated liquid, adding the stop solution immediately after the determination results.

9 od determination of each hole at the wavelength of 450nm.

The result of judgment and analysis:

1, instrument value: Yu Bo 450nm ELISA od read the hole on the instrument

2, to the OD value as a vertical coordinate (y), corresponding ot standard concentrations as a horizontal coordinate (x), do have corresponding curve, sample ot content can be according to the OD value by standard curve conversion out corresponding concentration, multiplied by the dilution multiple; or with the standard concentration and the OD value calculated the regression equation of the standard curve, the sample OD value in the equation to calculate the sample concentration, multiplied by the dilution factor is the actual concentration of the sample.

3, detection range: 0-100ng/ml

4, sensitivity: 0.39ng/ml