Western Blot樣品制備是這個(gè)實(shí)驗(yàn)的第一步。而且是關(guān)鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)。所以我們在做wtstern blot實(shí)驗(yàn)應(yīng)注意以下問題：

1：在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。

2：選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵二硫鍵，使其形成一個(gè)各自多肽的溶液。

3：盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。

4：防止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應(yīng)在低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（建議加入合適的蛋白酶抑制劑）

5：樣品建議分裝成合適的量，然后冷凍干燥或直接以液體狀態(tài)置-80℃中保存，但要注意不要反復(fù)凍融。

下面我們詳細(xì)介紹一下western blot實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)步驟。

一.準(zhǔn)備工作：

一個(gè)水浴箱，一臺(tái)超聲裝置，組織勻漿器

三.操作步驟：

1)培養(yǎng)細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備：

1：胰酶酶解后裂解：

　細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時(shí)，以含0.05%胰蛋白酶消化，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，離心收集在離心管中，加入450μl裂解液反復(fù)吹打。

2：皿上直接裂解：

細(xì)胞培養(yǎng)至80%左右密度時(shí)，細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次，加入450μl裂解液，細(xì)胞刮刀收集，用移液器轉(zhuǎn)移至離心管中，反復(fù)吹打。

以上所得的樣品最終用超聲細(xì)胞破碎儀超聲處理，超聲時(shí)為5S，間歇時(shí)間為10S，功率為100-120W至溶液清澈無粘稠為止，處理過程在水浴中進(jìn)行，后4℃25000g離心1小時(shí)取上清或以最大強(qiáng)度超聲4次，每次15-30S，在每次超聲步驟之間將樣品轉(zhuǎn)置水浴中15S，加入Laemmli 樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合），強(qiáng)力混勻，樣品置100℃水浴箱里水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取出清液，將其移入另一潔凈試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒。（樣品可立即使用也可以分裝凍存，-20℃存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月）。

2)組織樣品的制備：

手術(shù)切除的組織塊迅速置于預(yù)冷的0.95生理鹽水中，漂洗數(shù)次，以清潔表面的血跡，將組織稱量后切成幾個(gè)較小的組織塊放入機(jī)戒組織勻漿器中，按組織凈重，裂解液=1：10的比例，加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿，離心收集上清（如有粘稠物可超聲處理，具體方法見細(xì)胞培養(yǎng)的樣品制備，也可以冷凍干燥降解核酸后，將凍干的蛋白質(zhì)樣品溶解在適當(dāng)?shù)纳蠘?buffer中，混勻后靜置3小時(shí)使樣品中的蛋白質(zhì)充分的溶解，有5分鐘即可，4度離心收集。）加入Laemmli樣品緩沖液（視蛋白樣品濃度，以1：1或1：2的比例混合）強(qiáng)力混勻，樣品置100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取上清液，將其轉(zhuǎn)入另一潔凈的試管中，至此，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒（樣品即可立即使用也可也可以分裝凍存，-20℃存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月。）

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