實(shí)驗(yàn)原理
1. DNA片段回收方法：DNA片段在適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠中，通上一定電壓進(jìn)行電泳，不同大小的DNA分子由于遷移率的不同而分離開(kāi)。切下帶有所需DNA片段的凝膠，用凍融法、玻璃奶回收法或商品化膠回收試劑盒將目的片段回收純化。
2. 利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3’末端加上一個(gè)非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3’T突出端的載體，在連接酶作用下，可以把PCR產(chǎn)物插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)，可用于PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序。

實(shí)驗(yàn)試劑
1. pMDTM18-T Simple Vector Kit(Takara公司)
2. TAE電泳緩沖液
3. 瓊脂糖(Agarose)
4. 6×電泳加樣緩沖液：0.25％溴粉藍(lán)，40％(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于 4℃。
5. 溴化乙錠(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用鋁箔或黑紙包裹容器，儲(chǔ)于室溫即可。
6. 70%乙醇
7. 膠回收試劑盒(Omega公司)

實(shí)驗(yàn)設(shè)備
1. 水平式電泳裝置

   1) 在微量離心管中配制下列DNA溶液，全量為5 μl。
   pMDTM18-T Simple Vector 1 μl
   Insert DNA 0.1 pmol～0.3 pmol
   dH2Oup to 5 μl
   2) 加入5 μl(等量)的 Solution I。
   3) 16℃反應(yīng)30分鐘。(2 kbp以上長(zhǎng)片段PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA克隆時(shí)，連接反應(yīng)時(shí)間請(qǐng)延長(zhǎng)至數(shù)小時(shí))。
   4) 全量(10 μl)加入至100 μl 感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘。
   5) 42℃加熱45秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。
   6) 加入890 μl LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60分鐘。
   7) 在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落。計(jì)數(shù)白色、藍(lán)色菌落。
   8) 挑選白色菌落，鑒定載體中插入片段的長(zhǎng)度大小。

注意事項(xiàng)

1. 使用新鮮的電泳緩沖液TAE Buffer。不要重復(fù)使用，其PH的升高會(huì)減少產(chǎn)量。
2. 不論采取何種方法回收DNA，在回收過(guò)程中，要盡量減少洗脫體積，以便提高收得率和濃度，以方便后續(xù)操作。
3. 從膠上回收DNA時(shí)，應(yīng)盡量縮短光照時(shí)間并采用長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈(300-360nm)，以減少紫外光對(duì)DNA的切割。DNA曝露在紫外燈下不能超過(guò)30秒。
4. 連接反應(yīng)時(shí)間是與溫度密切相關(guān)，因?yàn)榉磻?yīng)速度隨溫度的提高而加快。通�？刹捎�16℃連接4小時(shí)為宜，如是平端連接需要適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間以提高連接效率；在選擇反應(yīng)的溫度與時(shí)間關(guān)系時(shí)，也要考慮在反應(yīng)系統(tǒng)中其他因素的影響。
5. 連接反應(yīng)的整個(gè)過(guò)程應(yīng)注意槍頭的潔凈以避免造成對(duì)酶的污染，為防止酶活性降低，取酶時(shí)應(yīng)在冰上操作且動(dòng)作迅速。
6. 連接反應(yīng)應(yīng)在25℃以下進(jìn)行，溫度升高較難形成環(huán)狀DNA，影響連接效率。長(zhǎng)片段PCR產(chǎn)物(2kb以上)進(jìn)行連接時(shí)，連接反應(yīng)時(shí)間應(yīng)延長(zhǎng)至數(shù)小時(shí)。
7. 進(jìn)行克隆時(shí)，Vector DNA和Insert DNA的摩爾數(shù)比一般為1:2~10。根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況選擇合適的摩爾數(shù)比。
8. 用高效的感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化效率≥1×108 cfu/μg pUC19)，這樣才可能得到比較理想的陽(yáng)性克隆。