從 2013 年 1 月份開始到現(xiàn)在，近 2 年的時(shí)間里，CRISPR/Cas9 技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域被來(lái)自全球優(yōu)秀的科學(xué)家們不斷的擴(kuò)大。其中包括基因敲除，定點(diǎn)突變，定點(diǎn)整合，基因沉默，基因定位和 CHIP 等多個(gè)領(lǐng)域，而且這個(gè)技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域還在不斷的被擴(kuò)大。

相比于其它重組技術(shù)，使用 CRISPR/Cas9 技術(shù)做基因敲除是效率最高，成本最低的技術(shù)。其中的關(guān)鍵因素?zé)o異于下面幾點(diǎn)：

1) 明確需要敲除的基因序列

首先需要明確內(nèi)含子和外顯子序列；可以登錄 NCBI 或者 UCSC 的網(wǎng)站可以方便的查到；

2) 合適的靶位點(diǎn)選擇

一般建議設(shè)計(jì) 2-3 條，然后轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，用 Cruiser™ 和測(cè)序的方法驗(yàn)證哪個(gè)靶位點(diǎn)的活性最好；也可以登錄 CRISPR/Cas9 敲除載體庫(kù)：（查看載體庫(kù)詳細(xì)頁(yè)） 看看是否有自己要研究的基因，這個(gè)載體庫(kù)中的靶位點(diǎn)都是在細(xì)胞體內(nèi)經(jīng)過活性驗(yàn)證，保證敲除活性的；

3) 敲除載體選擇

根據(jù)需要可以選擇空載體，帶抗性的載體（Puro/Neo），帶熒光標(biāo)記的載體（EGFP/RFP），雙敲除載體等。其中空載體較�。�8K），可以提高轉(zhuǎn)染的效率；抗性便于后面進(jìn)行抗性篩選，熒光標(biāo)記的載體便于進(jìn)行流式分選；

4) 單細(xì)胞生長(zhǎng)

不同的細(xì)胞單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況不一樣。有的細(xì)胞長(zhǎng)的快，有的細(xì)胞長(zhǎng)的慢，有的單個(gè)細(xì)胞幾乎就不長(zhǎng)。這個(gè)就需要采取不同的方案了，這里推薦一個(gè)單細(xì)胞培養(yǎng)的小耗材：Cell Plaza™。設(shè)計(jì)精巧，采用的是共培養(yǎng)的原理，如果碰到不好長(zhǎng)的單個(gè)細(xì)胞，可以試一試。同時(shí)，這個(gè)對(duì)于植物細(xì)胞做敲除時(shí)的小愈傷的生長(zhǎng)很有幫助。從事植物基因敲除方向的研究人員，也可以試一試；

 5) 陽(yáng)性克隆篩選

除了敲除外，CRISPR/Cas9還可以應(yīng)用在定點(diǎn)突變，定點(diǎn)整合，基因沉默，基因定位等各個(gè)方向，每個(gè)方向都有不同的細(xì)節(jié)需要把握。這里就不一一闡述，如果需要了解更多其它信息，可以隨時(shí)和我們聯(lián)系。也可關(guān)注吉銳生物官方微信（微信號(hào)：Genloci），參與互動(dòng)。