Western Blot內參的選擇不容忽視
要檢測一個基因的表達產(chǎn)物是否正確，或者比較表達產(chǎn)物量的相對變化，首選方法是Western Blot。因為Western Blot操作相對簡單方便，既可以定性分析表達產(chǎn)物，同時還可以指示目的蛋白量的相對變化。雖然，順利的時候Western Blot做起來很簡單，可不順的時候也很令人心煩――做不出結果、假陽性、結果出現(xiàn)多條帶、到底是一抗的問題還是二抗的問題等等……畢竟，作為一種有活性的生物大分子，抗體和抗原的反應畢竟不像1+1那么明確，而用這種不確定的試劑來測定同樣知之甚少的表達產(chǎn)物，確實是有一定的不確定性。所以，嚴謹?shù)腤estern Blot實驗設計中要求有良好的參照體系，對實驗結果分析是非常有用的。特別是當實驗出現(xiàn)問題時，借助參照體系很容易就可以查出問題所在，而不必抓耳撓腮怨天尤人。良好的參照體系通常包括分子量Marker（用來確定蛋白條帶對應的分子量大�。⒖瞻纵d體對照（如果是誘導表達體系還應該有誘導前的對照）、已知量標準產(chǎn)物的正對照，另外還有內參。可是由于經(jīng)費限制或者偷懶的原因，國內的不少人做Western Blot往往省略參照，導致結果出現(xiàn)問題時無法分析結果，即便有結果也可能影響結果的分析。
內參即是內部參照（Internal Control），對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。在Western Blotting實驗中，除了需要進行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進行內參的檢測，以校正蛋白質定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。
實際上內參是最容易被忽略的一項。我們知道，要用Western Blot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達量的相對多少，前提條件是等量的細胞上樣，才有比較的基礎，特別表達量不高時，上樣量的差別就很可能影響結果的分析，所以需要內參。在國外發(fā)表的文章中，Western Blotting實驗結果須進行內參校正已成為一種慣例。但是，國內仍有不少科研人員在Western Blotting實驗中忽略了內參的使用，將蛋白濃度測定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯一方法。
然而各種蛋白質濃度定量方法，都存在局限性，不能完全準確的確定各種樣品的蛋白濃度。如UV法直接定量，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質，相對于比色法來說，操作簡單，但是容易受到平行物質如DNA的干擾，且敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法測定蛋白濃度一般有BCA、Bradford、Lowry 等幾種方法。BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。Bradford法敏感度最高，且與一系列干擾Lowry、BCA 反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容，但是對去污劑依然是敏感的，其最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。另外，蛋白質定量以后進行電泳時需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在Western blotting實驗時使用內參，即可簡便地對定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進行校正。
在Western Blotting中使用內參其實就是在WB過程中另外用內參對應的抗體檢測內參，這樣在檢測目的產(chǎn)物的同時可以檢測內參的表達，由于內參在各組織和細胞中的表達相對恒定，借助檢測每個樣品內參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結果才更為可信。此外使用內參可以作為空白對照，檢測蛋白轉膜情況是否完全、整個Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。
在Western Blotting實驗過程中使用內參的方法通常有一下三種。第一種是超級簡便的標記內參使用法，只要在二抗孵育時加入HRP標記內參抗體，按照正常操作即可；第二種是普通內參，當目的蛋白的分子量大小與選用的內參蛋白分子量相差不大時，可以先進行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測，然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進行內參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。第三種，當目的蛋白的分子量大小與選用的內參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉膜后預染，根據(jù)蛋白質Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內參蛋白與目的蛋白分開，然后兩塊膜分別與內參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行溫育，二抗溫育以及顯色。
常用的蛋白質內參有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和細胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。一般我們選擇內參與要檢測的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你檢測的蛋白的分子量來選擇合適的內參！
產(chǎn)品詳情：
http:///tools/search.asp?kw2=GAPDH&tn=5
http:///tools/search.asp?kw2=beta-actin&tn=5
http:///tools/search.asp?kw2=beta-tubulin&tn=5
actin即肌動蛋白，是細胞的一種重要骨架蛋白。actin大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括alpha-skeletal muscle actin、alpha-cardiac muscle actin、alpha-smooth muscle actin和gamma-smooth muscle actin，其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括beta-actin(β-non-muscle)和gamma-non-muscle actin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中的beta-actin分布就很少，心肌主要是alpha-cardiac muscle actin。因此不同的組織本來就應該選擇不同的內參，不能一概而論的。beta-actin作為內參是得到了公認的，這是針對大多數(shù)組織和細胞來說的，它廣泛分布于細胞漿內，表達量非常豐富。盡管最近有一些文章已經(jīng)開始質疑beta-actin作為內參的有效性，但是發(fā)文章應該還是沒有問題的。至于其他的內參也是可以考慮用的，GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）是參與糖酵解的一種關鍵酶，而tubulin和actin類似，是細胞骨架的組成部分，但是不是肌肉的主要成分，應該是一個代替品。三種同時發(fā)生變化的情況很少，需要具體分析。一旦出現(xiàn)上述三種內參同時發(fā)生變化，如果是總蛋白可以用胞核的內參如PCNA，TATA-box binding protein（TBP）甚至線粒體的內參來代替，當然一般這種可能性出現(xiàn)的幾率微乎其微。
不同異構體表達對蛋白的檢測是有很大的影響，買抗體前要好好熟悉自己的目的蛋白，很多抗體雜不出條帶其實未必是抗體質量的問題。很多公司的內參抗體是用抗原片段制備的，不同的公司選擇的片段不一樣。以最常用的beta-actin為例，有的公司選擇N-端，有的選擇C－端。選用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作為抗原制備抗體(單抗和多抗)的占大多數(shù)，這類抗體均不能檢測心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用C-端16aa短肽作為抗原制備抗體的，這類抗體可以在肌肉細胞中檢測到actin陽性信號。有時候在實驗中檢測內參時產(chǎn)生“組織特異性”，就是由于抗體選擇不對造成的。
actin幾種異構體存在組織分布特異性，不同型actin之間具有較高的序列相似性(>90%)。β-actin是分布于非肌細胞中的一種骨架蛋白，選擇作β-actin內參時首先得保證是組織廣泛表達的（尤其是做蛋白的組織表達譜時）。那么制備β-actin抗體的抗原應該是選用與actin其它異構體一致的氨基酸序列。公司制備抗體是選用beta-actin的某一段小短肽作為免疫原，可能會因為選取的短肽在不同型actin之間保守與否，導致所制備抗體具有一定的組織特異性。選取的短肽僅在beta型存在，得抗體就僅能檢測非肌細胞中的actin，取的短肽在六型中均存在，此抗體除非肌細胞外，可以檢測cardiac，skeletal，smooth muscle細胞的actin。
標簽：
Western Blot
內參選擇
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