1.引物最好在模板cDNA 的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)。

      DNA 序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI 上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對(duì)（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。

2.引物長度一般在15~30 堿基之間。

      引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。

3.引物GC 含量在40%~60%之間，Tm 值最好接近72℃。

      GC 含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC 含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm 值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm 值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計(jì)引物的Tm 值，則有效引物的Tm 為55~80℃，其Tm 值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。

4.引物3′端要避開密碼子的第3 位。

      如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3 位，因密碼子的第3 位易發(fā)生簡并，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率。

5.引物3′端不能選擇A，最好選擇T。

      引物3′端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A 時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T 時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G、C 錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A、T 之間，所以3′端最好選擇T。

6. 堿基要隨機(jī)分布。

      引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)（False

priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3 個(gè)連續(xù)的G 或C，因這樣會(huì)使引物在GC 富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。

7. 引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。

      引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin）使引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4 個(gè)堿基的互補(bǔ)。

      兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3′ 端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體（Dimer 與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4 個(gè)堿基的互補(bǔ)。

      引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其△G 值不要過高（應(yīng)小于4.5kcalmol）。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行。

8. 引物5′ 端和中間△G 值應(yīng)該相對(duì)較高，而3′ 端△G 值較低。

      △G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性，△G 值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5′ 端和中間△G 值相對(duì)較高，而3′ 端△G 值較低（絕對(duì)值不超過9）的引物。引物3′ 端的△G 值過高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。（不同位置的△G 值可以用Oligo 6 軟件進(jìn)行分析）

9.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。

      引物的5′ 端決定著PCR 產(chǎn)物的長度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′ 端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA 序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。

      引物的延伸是從3′ 端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′ 端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能。

10. 擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。

      某些引物無效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件（比如RNAstructure）可以預(yù)測估計(jì)mRNA 的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（△G°）小于58.6l kJmol 時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2′-脫氧GTP 取代dGTP 對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。

11. 引物應(yīng)具有特異性。

      引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行BLAST 檢測。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。

值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC 含量偏高或偏低，導(dǎo)致找

不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；用作克隆目的的PCR，因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。