實(shí)驗(yàn)器材
手術(shù)小直剪刀三把、眼科直鑷子三把、眼科彎鑷子兩把、玻璃平 皿三套、200目尼龍濾網(wǎng)、50ML、15ML離心管和手術(shù)刀片。以上物品均需要高壓滅菌消毒處理。
實(shí)驗(yàn)試劑
無Ca2+和Mg2+的 PBS、0.05%胰酶0.53mmol/L EDTA溶液、小鼠胚成纖維細(xì)胞(MEF)生長培養(yǎng)基:高糖DMEM加10%FCS。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
孕期14至16天的孕鼠
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 處死孕鼠,置于75%酒精里全身浸泡,然后在超凈臺中用一把剪刀和一把鑷子把孕鼠外皮剪開,用另外一把剪刀和一把鑷子把內(nèi)皮剪開,露出子宮,最后用第三把剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中,沖洗去血。
2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除,然后夾掉頭和內(nèi)臟,將其余胚胎轉(zhuǎn)移到一個(gè)裝有30MLPBS的50ML離心管中,輕輕顛倒兩次,倒掉PBS,再重復(fù)此步驟一次,留少許PBS將胚胎轉(zhuǎn)移到另一裝有PBS的平皿中,用手術(shù)刀片將其細(xì)細(xì)切碎。
3.用200ul的移液槍反復(fù)快速吹打平皿中的液體,放在15ML離心管中,4℃1500rpm離心5分鐘,倒掉上清,加10ML胰酶,重懸沉淀,放37℃水浴中消化30分鐘,且每隔五分鐘輕輕晃動(dòng),使之充分消化。
4.將上層細(xì)胞懸液倒入一裝有 10MLMEF生長培養(yǎng)基的50ML離心管中,用200目尼龍濾網(wǎng)過濾后,1500rpm離心5分鐘收集細(xì)胞。30ML MEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次(此步驟中作者試過用無血清的培養(yǎng)基洗滌,結(jié)果無差別)。
5.細(xì)胞沉淀用15ML生長培養(yǎng)基懸起,細(xì)胞計(jì)數(shù)(八只14天胎鼠可獲得2-3×107細(xì)胞)。
6.3×106細(xì)胞懸浮于15ML MEF生長培養(yǎng)基中,接種到200ML的培養(yǎng)瓶中。
7.24小時(shí)后更換新鮮的MEF生長培養(yǎng)基。
8.細(xì)胞長滿后,先用PBS沖洗,倒掉,加胰酶消化(此步時(shí)間不宜過長,作者一般不超過五分鐘),按1:5傳代。
9.細(xì)胞再次長到覆蓋率80-90%左右,將其消化后,常規(guī)凍存。(凍存液要現(xiàn)配)
五、討論
1.原代培養(yǎng),一定要避免污染。
2. MEF生存能力有限,如果不凍存,體外存活十代左右。
3. 凍存后復(fù)蘇的細(xì)胞只能傳代一次,因?yàn)檫@些細(xì)胞繁殖能力有限。
4. 消化細(xì)胞時(shí)間不要過長。