CHO細胞無血清培養(yǎng)入門技術(shù)手冊

——深圳百恩維生物

1、CHO細胞背景

      CHO細胞是中國倉鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)，1957年美國科羅拉多大學(xué)Dr. Theodore T. Puck從一成年雌性倉鼠卵巢分離獲得，為上皮貼壁型細胞，是目前生物工程上廣泛使用的細胞系。工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用較多的是CHO-K1細胞，為轉(zhuǎn)化細胞系，細胞染色體分布頻率是2n＝22，系亞二倍體細胞。ATCC保存CHO-K1細胞株，編號為CCL-61，被廣泛地用于重組DNA蛋白的表達。由于該細胞存在遺傳缺陷，無脯氨酸合成基因，不能將谷氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楣劝彼?/SPAN>-γ-半醛，培養(yǎng)過程中需在培養(yǎng)基中添加L-脯氨酸才能生長。并且由于該細胞已經(jīng)霍亂毒素適應(yīng)，形態(tài)學(xué)有所改變。最初細胞為貼壁型細胞，經(jīng)多次傳代篩選后，也可懸浮生長。

2 、CHO 細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)勢與特點

     由于哺乳動物細胞結(jié)構(gòu)、功能和基因表達調(diào)控的復(fù)雜性，外源基因在哺乳動物細胞中的表達與在原核生物中的表達存在較大差異，因而外源基因在哺乳動物細胞中高效表達所需的元件也不同于在原核生物細胞中的表達所需的元件。外源基因在哺乳動物細胞中的表達包括基因的轉(zhuǎn)錄、mRNA 翻譯及翻譯后蛋白質(zhì)的加工等過程，如蛋白質(zhì)的糖基化、磷酸化、寡聚體的形成以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵的形成等比較復(fù)雜，要表達具有生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)如膜蛋白、抗體和具有特異性催化功能的酶需要在哺乳動物細胞中進行。哺乳動物基因表達宿主細胞選擇的基本原則是來源豐富、轉(zhuǎn)化效率高、表達效果好，CHO 細胞作為表達系統(tǒng)除具有上述的特點要求外，還有以下優(yōu)勢：

1）外源基因被整合到宿主染色體上后，在沒有選擇壓力的情況下能穩(wěn)定保持；

2）適合多種蛋白質(zhì)的分泌表達和胞內(nèi)表達，并且很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，便于下游產(chǎn)物分離純化；

3）對培養(yǎng)基的要求較低，可在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

4）細胞可進行貼壁培養(yǎng)也可進行懸浮培養(yǎng)，且具有較高的耐受剪切力和滲透壓能力；

5）可進行高密度大量培養(yǎng)，進行較大規(guī)模生產(chǎn)時其培養(yǎng)量可放大到20000L 以上，是目前應(yīng)用最廣泛的哺乳動物基因表達受體細胞之一。

    另有研究者嘗試將類胰島素生長因子IGF 基因和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入CHO 細胞獲得能自身分泌必需蛋白的“超級CHO”，無需在培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)鐵蛋白和胰島素，細胞可在無血清培養(yǎng)基（SFM）中生長良好。

3、CHO細胞無血清無動物源成分培養(yǎng)基

     帶血清的細胞培養(yǎng)基因為血清的組成具有不確定的性，可控性、重現(xiàn)性都比較差，不利于產(chǎn)業(yè)化、規(guī)�；�。而無血清無動物源培養(yǎng)基組成確定，重現(xiàn)性、可控性都比較好，因此不管是科研客戶還是臨床治療客戶，越來越趨向于采用無血清無動物源的培養(yǎng)基來培養(yǎng)CHO細胞。目前, 大部分CHO細胞培養(yǎng)均可在無血清培基中進行, 采用無血清培養(yǎng)取代傳統(tǒng)血清培養(yǎng)已成為CHO細胞培養(yǎng)的發(fā)展必然趨勢。無血清培基已廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)、藥理學(xué)、腫瘤學(xué)、細胞工程領(lǐng)域和臨床治療。

     深圳百恩維生物依托于在細胞培養(yǎng)基研發(fā)和動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)方面具有豐富經(jīng)驗的研發(fā)團隊，潛心研究，開發(fā)研制了多種個性化培養(yǎng)基，通過在生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用已取得可喜的成果，如CHO細胞無血清無動物組分細胞培養(yǎng)基（BW12009）就是其中之一。

4、百恩維CHO細胞無血清培養(yǎng)基（BW12009）的特點

     BW12009是深圳百恩維生物開發(fā)的新一代CHO細胞無血清無動物組分細胞培養(yǎng)基，能支持多種CHO細胞的生長維持，可廣泛應(yīng)用于CHO細胞的無血清懸浮培養(yǎng)及抗體、重組蛋白、疫苗的生產(chǎn)過程。細胞培養(yǎng)基產(chǎn)品的生產(chǎn)、檢驗嚴(yán)格執(zhí)行GMP管理和ISO9001管理體系，符合生物制藥原輔料要求，質(zhì)量穩(wěn)定可靠。

1）系無血清無動物組分培養(yǎng)基，化學(xué)成分明確，保證了細胞培養(yǎng)中原輔料的使用安全性；

2）支持多種CHO細胞系的生長，包括貼附型與懸浮型細胞培養(yǎng)，具有較為廣泛的適用性；

3）可維持CHO細胞高密度培養(yǎng)，細胞增殖速度快，適用于實驗研究和大規(guī)模培養(yǎng)應(yīng)用；

4）根據(jù)用戶的不同使用，可定制培養(yǎng)基，以滿足各種等不同系統(tǒng)的應(yīng)用需求；

5）有多種包裝規(guī)格可供選擇，滿足不同用戶的使用需求。

5、定制CHO 細胞無血清培養(yǎng)基

     CHO 細胞存在多種克隆細胞系，ATCC 保存的CHO 細胞就多達38 種，再加上研究單位或百恩維類似的公司構(gòu)建的細胞，其克隆細胞數(shù)量遠不止這些。對于CHO細胞無血清培養(yǎng)而言，由于構(gòu)建的各種高性能CHO 細胞系不同，不同克隆細胞的營養(yǎng)要求也都非常的不同，對營養(yǎng)要求往往是個性化的。另外，CHO 細胞培養(yǎng)過程的不同培養(yǎng)階段、重組CHO 細胞株的各個階段，細胞代謝所需的營養(yǎng)或限制因素也是不同的，即同一CHO細胞系在整個培養(yǎng)過程也需要使用不同的培養(yǎng)基，需要與之相對應(yīng)的個性化培養(yǎng)基。百恩維已經(jīng)為多家世界著名的生物制藥公司提供個性化的CHO 細胞無血清培養(yǎng)基。

6、CHO 細胞無血清馴化

     在含血清培養(yǎng)基中生長的 CHO 細胞可經(jīng)過一定的細胞馴化過程，適應(yīng) 細胞培養(yǎng)基，進行細胞的無血清培養(yǎng)。百恩維提供已馴化過的CHO 細胞系。如果需要，研究者也可按照以下辦法進行CHO 細胞無血清馴化。

     已經(jīng)適應(yīng)無血清培養(yǎng)的CHO 細胞可直接在BW12009中實現(xiàn)無血清培養(yǎng)培養(yǎng)，建議前二代的細胞密度不低于4×105cells/ml。

細胞的無血清馴化過程如下：

1. 取處于對數(shù)生長期的貼壁 CHO 細胞，活率大于95%，開始進行無血清馴化。

2. 細胞馴化可以在方瓶（T-flask）、搖瓶（shake-flask）或轉(zhuǎn)瓶（spinner-bottle）中進行。

3. 將無血清細胞培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基的按 1：1（V/V）的比例進行混合，接種密度為2－4×105cells/ml 的細胞，在37℃、5％CO2 培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。

4. 根據(jù)細胞生長和活率情況，在降血清的每一階段可穩(wěn)定傳代 1－3 代，接種密度維持在2- 4×105cells/ml。

5. 逐步提高無血清細胞培養(yǎng)基在混合液中的比例（V/V），即降低混合液中的血清含量，傳代過程的細胞接種密度仍維持為2- 4×105cells/ml。直至混合液中的血清濃度降低至 0.1-0.2%，每一代的細胞活率大于90％后，此時可將細胞完全培養(yǎng)在CHO 無血清無動物組分培養(yǎng)基中。

6. 在 CHO 無血清無動物組分培養(yǎng)基中進行放大培養(yǎng)，建立起適應(yīng)無血清無動物組分培養(yǎng)的CHO 種子細胞庫。