peprotech細胞因子注意事項

      目前檢測單個細胞特定細胞因子的表達手段包括：ELIspot、原位雜交、免疫細胞化學、限制性稀釋分析（limiting dilution analysis，LDA）和單細胞PCR，應用原位雜交技術和免疫組化方法觀察細胞因子蛋白表達及mRNA表達可以識別Th1和Th2細胞，此方法可獲得較強的細胞內信號，但此方法工作量大、主觀性強，難以進行大樣本檢測，且人肉眼識別能力有很大的局限性，而ELISPOT及單細胞PCR技術，技術性強、勞動強度大，難以進行廣泛推廣。隨著多標記及胞內細胞因子標記流式細胞技術的出現(xiàn)，使對細胞內細胞因子的研究推向了一個新的階段。下面主要對胞內細胞因子流式細胞技術作以介紹。

早期細胞因子表達與細胞功能相關性研究是基于特定克隆">克隆細胞的激活。盡管研究應用T淋巴細胞克隆">）與TH2（IL－4，IL－5，IL－10），但這些研究很難外推，因為T細胞克隆"g克隆證明了不同細胞因子的合成，如TH1（IL－2，IFN－>克隆與體內T細胞功能相關性還未被揭示。

近來，Jung與Picker采用了monensin、PMA等藥物預孵，用Brefeldin（BFA）、Monensin阻斷了胞內高爾基體介導的轉運的方法使得細胞因子聚集，蓄積，增強細胞因子信號可被流式細胞儀檢測。因為自然狀態(tài)下，T淋巴細胞產生少量的細胞因子，通常要對T淋巴細胞體外活化進行研究。在體外刺激過程中，T淋巴細胞產生的細胞因子已釋放出來，胞內細胞因子信號較弱，難以進行檢測。這一方法可檢測單個細胞內多個細胞因子，并可區(qū)分表達特定細胞因子的細胞亞群。在細胞水平該方法證明了人與鼠的淋巴細胞都存在1型與2型分化，且這些分化在特定細胞因子增強時可被逆轉。且這些研究清楚地證明，只有激活的細胞亞群可以表達細胞因子，靜止的正常淋巴細胞（T、B、NK）不能分泌細胞因子。

胞內流式分析法是用抗細胞因子抗體與細胞表面或胞內特定亞群標志組合，即可檢測不同細胞亞群細胞因子的分泌，同時采用特殊的化學與抗體選擇，確保靜止與無細胞因子分泌細胞的最小熒光背景。具有其它方法難以比擬的優(yōu)點：

快速：流式定量檢測細胞內細胞因子可在一天內完成，實驗流程需6-8小時，實際操作時間為1-2小時，快速簡便；

簡便：無需組織培養(yǎng)，可以全血分析，無需分離PBMCs；

靈敏度高：高度靈敏的熒光標記與檢測系統(tǒng)；

高效：可以在同一個細胞內同時檢測兩種或更多種細胞因子，也可根據細胞免疫表型區(qū)分分泌細胞因子的細胞的亞型，進行多參數相關分析；

安全：減少樣本處理與生物源性污染

接近生物體的分析條件：全血檢測保留細胞及生化微環(huán)境更準確反映了體內狀況。

二、所需儀器

1、流式上樣管及細胞培養(yǎng)皿或板

2、25%CO₂，37℃孵箱

3、混勻振蕩器

4、離心機

5、加樣器、Tips

6、流式細胞儀

三、常用的標本類型和處理方法

全血：使用肝素鈉抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素鋰、EDTA和ACD抗凝劑，血樣在8小時內分析，超過8小時會導致活性的損失，一般細胞因子陽性細胞會減少5%。如不能在8小時之內檢測，應將真空采血管水平室溫放置。

自身血漿中外周血單個核細胞（PBMCs）：使用肝素鈉抗凝的采血后，分離PBMCs，24小時內分析。

組織培養(yǎng)基中的外周血單個核細胞（PBMCs）：用Ficoll分離PBMCs，將細胞重懸于含10%熱滅活胎牛血清（FBS）的RPMI－1640培養(yǎng)基中，調節(jié)細胞濃度為2×106細胞/ml。

調節(jié)細胞濃度2×106細胞/mL于新鮮培養(yǎng)基中。

冰凍全血與PBMCs：使用1×紅細胞裂解液處理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS重懸，－70℃凍存。溶化后細胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，離心5分鐘后，用破膜劑對細胞進行破膜和染色。

四、所需試劑

1、細胞表面染色的熒光標記的單抗試劑

依據實驗需要選擇特殊表面標志

CD45圈定所有淋巴細胞

CD3 圈定T淋巴細胞

CD4 圈定T輔助淋巴細胞亞群

CD8 圈定T抑制淋巴細胞亞群

CD19/或CD20圈定B淋巴細胞

CD56圈定NK淋巴細胞

CD14圈定單核細胞

2、熒光標記的細胞因子抗體

R&D提供FITC、PE和APC標記的細胞因子抗體

3、溶血素

用外周全血檢測時需使用溶血素（R&D目錄號WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience目錄號00-4333）溶解紅細胞

4、激活劑

① Phorbol 12-Myristate 13 Acetate（PMA）（Alexis，目錄號ALX-445-004-M001）

DMSO中調節(jié)濃度0.1mg/mL

L），－20℃儲存。勿反復凍融m分裝（20

每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：100稀釋儲存液

D.PMA終濃度25ng/mL細胞懸液

② Ionomycin （Alexis，目錄號ALX-450-006-M001）

于乙醇中配制成濃度0.5mg/mL

－20℃儲存

每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲存液

g/mL細胞懸液m③Ionomycin終濃度1

Staphylococcal enterotoxin B（SEB） （Sigma，Catalog No.S-4881）

無菌無疊氮鈉PBS調節(jié)濃度0.5mg/mL

4℃儲存

g/mL細胞懸液mSEB終濃度10

④ CD3：包被在培養(yǎng)板中，在蛋白轉運抑制劑存在下活化未稀釋的血液細胞

⑤ CD28：加速不同刺激劑（包括SEB、CD3等）的活化效應，濃度一般為10ug/ml

5、阻斷劑

阻斷高爾基體介導的轉運作用，使得刺激細胞表達的細胞因子聚集在胞漿內

① Brefeldin-A（BFA） （eBioscience，目錄號00-4506）

于DMSO中調節(jié)濃度5mg/mL

分裝（20L），-20℃儲存。勿反復凍融。

每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲存液

g/mL細胞懸液。m激活最后4－5小時BFA終濃度10

注意：BFA過度孵育會導致細胞活力下降

② Monensin （eBioscience，目錄號00-4505）

6、 不含谷氨酰胺的RPMI-1640

7、 固定劑

細胞在體外刺激后需要對細胞進行固定。固定的目的在于通過蛋白的交聯(lián)和變性一方面使細胞因子固定在細胞內，另一方面避免細胞表面抗原丟失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience，目錄號00-8222）

8、 破膜劑

含1%皂甙、0.05%疊氮化鈉的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience，目錄號00-8333）

將細胞膜穿孔，已利于熒光標記的細胞因子抗體進入細胞內，于相應的細胞因子結合

9、其它試劑

無菌無疊氮鈉PBS，乙醇，含1%多聚甲醛的PBS，4℃儲存。

五、細胞培養(yǎng)和刺激的基本方法

細胞活化的最終結果是產生細胞因子，根據檢測指標和標本的不同，研究人員需要選擇不同的刺激劑和刺激時間，以獲得最佳的實驗結果。下表提供了檢測一些常用細胞因子的推薦的活化方法。

表1、細胞內細胞因子流式檢測推薦的陽性對照活化方法

為防止細胞內細胞因子分泌到胞外，在培養(yǎng)的最后4-6個小時，需要使用蛋白轉運抑制劑（如3uM monensin，10mg/ml的BFA）

方法1：只使用轉染細胞檢測

方法2：人的PBMCs使用PMA （10 ng/ml） 和Ionomycin （1 uM） 刺激4-24 小時.

方法3：人的PBMC 使用LPS （0.5 - 1 ug/ml） 刺激24 小時.

方法4：人的PBMCs或者純化的CD4＋細胞在包被人CD3抗體的培養(yǎng)板中，使用含有重組人的IL-2（10 ng/ml，目錄號202-IL-010）和IL-4（10 ng/ml，目錄號204-IL-005）的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；細胞洗滌后在含有重組人IL-2和IL-4的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2天；最后收獲細胞，使用PMA（10 ng/ml） 和Ionomycin （1 uM）刺激6小時20mL于Falcon管中，加入100mL激活后的全血（細胞濃度維持在2×106/mL） 混勻，室溫暗處孵育15分鐘；

方法5： CD4 T 細胞使用PHA （10 ng/ml） 刺激4 days

方法6： T 細胞使用抗CD3 的單抗、抗CD28的單抗和重組人的IL-1b （Lorre, et al., 1994， Clin Immuno Immunopath 70:1）

方法7： 使用PMA （50 ng/ml） 和Ionomycin （500 ng/ml）刺激

 （10 ng/ml，目錄號285-IF-100） 刺激2 小時，然后使用IFN（10 ng/ml） LPS（1 ug/ml）刺激22小時或者使用相同的方法刺激THP-1 細胞.g方法8： PBMCs細胞使用重組人IFN

方法9： EL4 在包被抗小鼠CD3抗體（25 ug/ml）的培養(yǎng)板中，使用抗CD28抗體（2 ug/ml） PMA（5ng/ml） Ionomycin（500 ng/ml） 刺激6小時

方法10：CD4＋T細胞在包被小鼠CD3（25ug/ ml）抗體的培養(yǎng)板中，使用含有抗小鼠的CD28（2 ug/ml）的抗體，重組小鼠的IL-2（10 ng/ml，目錄號402-ML-020）和IL-4（50 ng/ml，目錄號404-ML-005）的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；然后在含有重組小鼠IL-2和IL-4的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3天；最后收獲細胞，使用PMA（5 ng/ml）、Ionomycin（500 ng/ml）和monensin刺激6小時。

方法11： 小鼠ip巨噬細胞使用Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激24小時

方法12： 小鼠脾細胞使用PMA（5 ng/ml）和Ionomycin（500 ng/ml）刺激6小時

六、流式檢測細胞染色基本過程（以全血為例）

1、收獲細胞

肝素鈉抗凝的靜脈血，按1：1與培養(yǎng)基混勻，加刺激劑，同時加蛋白轉運抑制劑（參照說明書）， 混勻后，37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)4-6小時

2、阻斷Fc受體

用于消除非特異性的結合染色

① 在小鼠，可使用純化的FcII/III受體的抗體（CD16/32），按照1ug/106細胞的用量，在染色緩沖液中4℃孵育15分鐘，PBS清洗后，直接進行下一步染色。

②對于人和大鼠，可直接使用過量的與熒光抗體相同來源和亞型不相關的純化Ig或者血清進行阻斷

3、細胞表面染色

① 加適當的細胞表面染色試劑

② 加入溶血素，室溫暗處孵育10分鐘。（注意：PMA激活的全血可能會溶血不完全。）

③離心500g 5分鐘，棄上清

4、固定和破膜

① 加固定劑，室溫暗處孵育15分鐘，離心500g 5分鐘，棄上清；

② 加破膜劑溫暗處孵育10分鐘。（劑量參照說明書）

3mLPBS洗液，離心500g 5分鐘，棄上清。~③ 加2

5、細胞內染色

① 加入熒光標記的細胞因子抗體，混勻，室溫暗處孵育30分鐘。

LPBS上機或加入500 L 1% PFA固定后再上機m② 加2、3mL洗液，離心500g 5分鐘，棄上清，加入500

七、注意事項

1、標本處理

避免使用絡合鈣的抗凝劑，如ACD與EDTA，因為它們會限制鈣依賴性激活過程，推薦用肝素鈉。此外LPS，一種常見的生物試劑污染物，是強細胞激活劑，可能會混淆試驗結果。血樣在8小時內分析，超過8小時會導致活性的損失，一般細胞因子陽性細胞會減少5%。如不能在8小時之內檢測，應將真空采血管水平室溫放置。

2、刺激激活

檢測不同的細胞因子根據情況選擇不同的刺激劑組合和刺激時間，以保證最佳的檢測效果。比如，要檢測IFN-γ則可選擇PMA和Ionomycin同時刺激；如果用CD4做表面標記，由于多數病人的CD4抗原會因PMA的激活而有不同程度的下調，所以培養(yǎng)時間不能太長，4-6小時為宜，否則CD4下調影響分析

3、選擇合適的對照

為保證結合的真是和可靠性，至少熒光設置以下對照：

①未刺激對照

激活時由于BFA的存在抑制了胞內蛋白的轉運，因此在激活過程中產生的抗原與細胞因子會滯留胞內，未刺激對照也應包含BFA。

② 激活對照

激活對照使用細胞表面表達CD69來評價激活與否，如果未達到CD69期望的水平，則激活步驟出了問題，某一試劑可能失活，過期，制備不當或溶劑污染，需制備新鮮刺激劑重新實驗。

③同型對照

使用與熒光標記抗體相同來源、相同標記、相同劑量和亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產生的背景染色。

4、Fc受體阻斷

使用試劑阻斷Fc受體可以有效減少非特異熒光染色，在小鼠可以用純化的抗小鼠的CD16/32（eBioscience， 目錄號14-0161-81），在大鼠可以用純化的抗大鼠的CD32，在人可以用過量的同種無關純化Ig或血清。

5、熒光素的選擇

檢測相對低表達細胞因子如IL-4時，應選用PE或APC標記；單檢測某一細胞因子時最好也選用PE或APC標記；同時檢測多種細胞因子時，弱表達的應選用PE或APC，F(xiàn)ITC標記最好用于高表達細胞因子如IFN-γ。

八、問題與解答