COX是一種膜結(jié)合酶，負(fù)責(zé)花生烯酸氧化生成前列腺素G2（PGG2）以及隨后PGG2轉(zhuǎn)變?yōu)镻HG2。這是各種前列腺素生成的第一步。COX至少有兩種不同的亞型，組成表達(dá)型COX-1，和誘導(dǎo)型COX-2。COX-1行使著看家功能，如血管止血，腎流血量，腎小球功能維護(hù)。COX-2存在于部分細(xì)胞內(nèi)，發(fā)出炎癥信號(hào)，如生長(zhǎng)因子，細(xì)胞因子和內(nèi)毒素。

試劑盒采用夾心酶免法，采用了兩種高特異性抗體，TMB作為著色劑，最終溶液所顯示的顏色強(qiáng)度與樣品中COX-2的量成正比

檢測(cè)范圍

1.09~70ng/mL

1.       試劑盒可用于細(xì)胞上清裂解液中人COX-2的檢測(cè)

細(xì)胞培養(yǎng)液

1）    將細(xì)胞培養(yǎng)液（1x10⁵~1x10⁷個(gè)細(xì)胞）加入至0.5ml的IBL裂解液中（貨號(hào)為#19022）

2）    在振蕩器上混勻或用移液槍吹打混勻

3）    2-8℃下旋轉(zhuǎn)30min使其溶解

4）    2-8℃，10000rpm下離心10min

5）    有必要的話用EIA緩沖液稀釋上清液

2.       細(xì)胞裂解液試驗(yàn)中，建議所用細(xì)胞數(shù)應(yīng)一致

3.       建議總蛋白濃度也同時(shí)檢測(cè)，可檢測(cè)到人COX-2與總蛋白的關(guān)系

1.       微孔板，96孔，包被有抗人COX-2鼠IgG單抗

2.       酶標(biāo)抗體濃縮液，30X，HRP標(biāo)記的抗COX-2兔IgG Fab片段,0.4ml

3.       標(biāo)準(zhǔn)品，重組人COX-2，0.5mlx2

4.       EIA緩沖液，30ml

5.       酶標(biāo)抗體稀釋液，內(nèi)含的1%BSA、0.05%的吐溫20的PBS緩沖液，12ml

6.       顯色劑，TMB，15ml

7.       終止液，1N硫酸，12ml

8.       洗滌緩沖濃縮液，50ml，40X，0.05%吐溫20的磷酸緩沖液

1.     酶標(biāo)儀（450nm）

2.     微量移液器和取樣吸頭

3.     帶刻度的量筒與燒杯

4.     蒸餾水

5.     溫育器（37℃±1℃）

6.     冷床箱（4℃）

7.     坐標(biāo)紙（log/log）

8.     吸水紙

9.     用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的試管

10.  洗滌瓶

11.  酶標(biāo)抗體稀釋的一次性試管

1.       洗滌緩沖液制備：先將洗滌濃縮液平衡至室溫，充分混勻，然后吸取50ml濃縮液與1950ml的去離子水混勻，即得。配制的洗滌液應(yīng)保存于冰箱內(nèi)，并于2周內(nèi)用完

2.       標(biāo)記抗體的制備：用標(biāo)記抗體稀釋液將標(biāo)記抗體稀釋30倍，即得。

例：如果只測(cè)一條板，8孔，則需要標(biāo)記抗體800ul（30ul的標(biāo)記抗體濃縮+870ul的標(biāo)記抗體稀釋液，混勻，使用時(shí)每孔加100ul）

此步驟在實(shí)驗(yàn)前完成

剩余的標(biāo)記抗體濃縮應(yīng)裝于密封瓶?jī)?nèi)，保存在4℃

3.       標(biāo)準(zhǔn)品的制備：吸取0.5ml的去離子水至標(biāo)準(zhǔn)品瓶?jī)?nèi)，充分混勻，得到140ng/ml的人COX-2標(biāo)準(zhǔn)品

4.       標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋：準(zhǔn)備8個(gè)試管用于標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋，每管加入230ul的EIA緩沖液

每管的濃度如下

1號(hào)管                 70 ng/ml

2號(hào)管                 35ng/ml

3號(hào)管                 17.5ng/ml

4號(hào)管                 8.75ng/ml

5號(hào)管                 4.38ng/ml

6號(hào)管                 2.19ng/ml

7號(hào)管                 1.09ng/ml

8號(hào)管                 0pg/ml（試驗(yàn)樣品空白）

吸取230ul的標(biāo)準(zhǔn)品于1號(hào)管混勻，然后從1號(hào)管吸取230ul加入2號(hào)管，依次連續(xù)稀釋，標(biāo)準(zhǔn)品范圍為70~1.09ng/ml

5.       樣品稀釋：樣品用EIA緩沖液稀釋

使用前，所有樣品應(yīng)平衡至室溫，大約30min，然后充分混勻，確保試劑質(zhì)量無變化，標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行

1.     確定好空白孔，并在相應(yīng)的微孔中加入100ul EIA緩沖液。

2.     確定好樣品對(duì)照孔，檢測(cè)樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔，然后分別將100ul樣品對(duì)照品、檢測(cè)樣品和稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品加入到相應(yīng)的微孔中。

3.     蓋板，37℃孵育60min

4.     用洗瓶洗板，在微孔中加入洗滌液再浸泡15-30秒，棄取洗滌液。重復(fù)7次，最后在吸水紙上拍干。如果是用洗板機(jī)洗板時(shí)，用洗板機(jī)洗四次后，再用洗瓶洗3次。

5.     每孔加入100ul酶標(biāo)抗體。

6.     蓋板，4℃下溫育30min

7.     按照步驟4）洗板9次

8.     將所需量的顯色劑加入到試管中，然后每孔內(nèi)加入100ul顯色劑。為了避免污染，請(qǐng)勿將剩余試劑倒入顯色劑原裝瓶中。

9.     室溫避光溫育30min，加入顯色劑后溶液顏色會(huì)變成藍(lán)色

10.  每孔中加入100ul終止液，此時(shí)溶液顏色會(huì)變成黃色。

11.  除去包被板孔底的雜質(zhì)或水滴，同時(shí)確保液體表面無泡沫， 30min內(nèi)在450處讀取OD值。

1.     樣品采集后應(yīng)立即檢測(cè)，如需貯存的，則應(yīng)放置在冰凍條件下，避免反復(fù)凍融，檢測(cè)前應(yīng)在低溫下將其溶解并完全混合

2.     如有需要，樣品可用EIA緩沖液稀釋

3.     建議試驗(yàn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品做雙份檢測(cè)

4.     試驗(yàn)樣品應(yīng)在中性PH范圍內(nèi)，有機(jī)溶劑的污染會(huì)影響試驗(yàn)

5.     只能使用試劑盒內(nèi)提供的洗滌液洗板，洗板不充足可能會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)失敗

6.     徹底倒去洗滌液，吸水紙上拍干，不能用吸水紙擦拭微孔

7.     底物液應(yīng)避光保存，因其對(duì)光敏感，且要避免接觸金屬

8.     加入終止液后30min內(nèi)讀數(shù)

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線前，將所有的檢測(cè)孔（包括標(biāo)準(zhǔn)品和未知樣品）的OD值都減去檢測(cè)樣品空白孔的OD值。在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上，以標(biāo)準(zhǔn)品的OD值（減去空白后的值）對(duì)其相應(yīng)的濃度，通過這些點(diǎn)作一條平滑的標(biāo)準(zhǔn)曲線。我們可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取未知樣品的濃度值。

典型標(biāo)準(zhǔn)曲線

附：采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)，只需檢測(cè)前設(shè)置好酶標(biāo)儀的相關(guān)參數(shù)，如坐標(biāo)參數(shù)（線性，半對(duì)數(shù)）和計(jì)算方式參數(shù)（三次回歸、四參數(shù)或雙對(duì)數(shù)曲線方程），即可直接得到結(jié)果

 

 

本譯文僅供參考，詳情請(qǐng)以原文為準(zhǔn)。