CYFRA 21-1(化學發(fā)光法)檢測試劑盒
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預期用途
此試劑盒基于化學發(fā)光免疫原理,用于血清和肝素血漿中CYFRA 21-1的檢測,此試劑盒僅用于研究
說明
此試劑盒采用兩種鼠單抗KS19.1和BM19.21來檢測細胞角蛋白19片段
實驗原理
此試劑盒采用的是化學發(fā)光免疫法,基于夾心原理
包被板上包被有能結(jié)合CYFRA 21-1分子上獨特抗原位點的單克隆小鼠抗體,含有內(nèi)源性CYFRA 21-1的樣品與HRP標記的抗CYFRA 21-1抗體酶聯(lián)物共同孵育,洗去未結(jié)合的酶聯(lián)物,樣品中CYFRA 21-1的濃度與結(jié)合的酶聯(lián)物的量成正比,加入底物液之后,樣品中的CYFRA 21-1濃度與顏色強度成正比
注意事項及預防措施
1. 試劑僅供專業(yè)人士使用
2. 試劑盒中的所有試劑包括檢測過的人血清/血漿對HIV/II,HbsAg和HCV都表現(xiàn)為陰性,所有的試劑在使用和處理的過程中都應當作潛在生物有害物質(zhì)進行處理
3. 開始試驗前,請仔細閱讀說明書,確定所有的事項都已明白
4. 微孔板是可拆的,不用的板條應固定在板架上,裝在密封袋內(nèi)保存于2-8℃
5. 加樣時應按相同的順序快速加樣
6. 不同的試劑裝在不同的試劑瓶內(nèi),不能混用,如果用事先裝了酶聯(lián)物的瓶子再裝底物液,則顏色會發(fā)生變化。不要將剩余的試劑倒回原裝瓶內(nèi),以免污染
7. 充分混勻孔內(nèi)成分,以達到很好的試驗結(jié)果。微孔板不可重復使用
8. 試驗過程中,不要讓孔內(nèi)出現(xiàn)干燥情況,洗板步驟過后應立即加樣
9. 試驗開始前,所有試劑平衡至室溫,溫度會對試驗結(jié)果有影響
10. 不要用嘴吸取樣品,避免皮膚接觸到試劑和樣品
11. 實驗區(qū)內(nèi)禁止飲食或化妝
12. 處理試劑和樣品時應戴一次性手套。微生物污染可能會導致結(jié)果失敗
13. 按照相應的國家生物安全管理條理進行操作
14. 不要使用過期的試劑
15. 所有試劑的量都應按說明來,使用校正的移液器和發(fā)光儀可得到最佳的結(jié)果
16. 發(fā)光底物液對光敏感,應避免陽光直射,保存于黑暗處
17. 不要混合使用不同批次的試劑,板條。試劑盒的運輸和貯存環(huán)境不同可能會導致結(jié)果有微小的區(qū)別
18. 有些試劑內(nèi)含有Proclin300,BND和MIT作為防腐劑,萬一眼睛或皮膚接觸到了應立即用水沖洗
19. 按照相應的國家生物安全管理條理公認的方法處理樣品和試劑
20. 有害物質(zhì)的相關信息請參考MSDS,產(chǎn)品的MSDS可直接向DRG索取
試劑盒組成
1. 微孔板,12x8, 96孔,可拆,包被有抗CYFRA 21-1抗體(單克。
2. 標準品,0-4,5支,凍干粉,1.0ml,濃度為:0;3;10;25;50ng/ml 含0.03%的Proclin300,BND和0.01%的MIT作防腐劑
3. 質(zhì)控,1支,1.0ml,質(zhì)控值和范圍請見QC質(zhì)控單 含0.03%的Proclin300,BND和0.01%的MIT作防腐劑
4. 樣品稀釋液,1支,3ml,即用,含0.03%的Proclin300,BND和0.01%的MIT作防腐劑
5. 酶聯(lián)物,21X,1支,0.5ml,HRP標記的抗CYFRA 21-1抗體,含0.03%的Proclin300,BND和0.01%的MIT作防腐劑
6. 酶聯(lián)物稀釋液,1支,7ml,即用,含0.03%的Proclin300,BND和0.01%的MIT作防腐劑
7. 底物液
試劑A,1支,2.0ml,注意:光敏感
試劑B,1支,2.0ml,注意:光敏感
試劑C,1支,5.0ml
8. 洗滌液,1支,30ml,40X
實驗所需材料但試劑盒未提供
1. 發(fā)光光度計
2. 校正的移液器
3. 吸水紙
4. 去離子水或雙蒸水
5. 計時器
6. 半對數(shù)坐標紙或數(shù)據(jù)處理軟件
貯存條件
試劑準備
實驗前將所有試劑平衡至室溫
標準品
向標準品瓶內(nèi)加1ml去離子水配制
2-8℃下可保存至少4周,在-20℃下可保存更長時間
質(zhì)控品
向質(zhì)控品瓶內(nèi)加1ml去離子水,放置10min,使用前反復混勻
2-8℃下可保存至少4周,在-20℃下可保存更長時間
洗滌液
加去離子水稀釋40X的濃縮洗滌液
30ml的濃縮洗滌液+1170ml的去離子水,即得1200ml的工作洗滌液
室溫下可保存2周
酶聯(lián)物
用酶聯(lián)稀釋液以1:21的比例稀釋
配制的酶聯(lián)物24小時內(nèi)使用
例如:如果板條全部使用,吸取300ul的濃縮酶聯(lián)物,加上6ml的酶聯(lián)物稀釋液,即得
如果板條不全使用,吸取25ul的濃縮酶聯(lián)物,加上0.5ml的酶聯(lián)物稀釋液,即得
相關酶聯(lián)物制備見下表
板條數(shù)
|
酶聯(lián)濃縮物
(ul) |
酶聯(lián)稀釋液
(ml) |
1 |
25 |
0.5 |
2 |
50 |
1.0 |
3 |
75 |
1.5 |
4 |
100 |
2.0 |
5 |
125 |
2.5 |
6 |
150 |
3.0 |
7 |
175 |
3.5 |
8 |
200 |
4.0 |
9 |
225 |
4.5 |
10 |
250 |
5.0 |
11 |
275 |
5.5 |
12 |
300 |
6.0 |
化學發(fā)光底物液
試劑A和試劑B混合,然后以1:2的稀釋比例用試劑C稀釋,即得即用的底物液
現(xiàn)配現(xiàn)用,只能保存1小時
如果所有板條都使用,則試劑A和試劑B各1.5ml混合+3ml的試劑C
樣品采集和準備
試驗可采用血清和肝素血漿
檸檬酸鹽血漿值減小,EDTA血漿值增高
不要使用溶血,黃疸或脂血的樣品
注意:不要使用含有疊氮化物的樣品
樣品采集
血清
靜脈穿刺采血,允許凝集,室溫下離心分離出血清。未完全凝固時不可進行離心。接受了抗凝劑治療的捐獻者的血液凝集時間更長
血漿
將全血收集到含有抗凝劑的離心管內(nèi),采集后立即離心
樣品貯存和準備
實驗前,將樣品蓋上蓋子,貯存于2-8℃,可保存2天,想保存更長時間則需凍存于-20℃,避免反復凍融
樣品稀釋
在最初的試驗中,如果樣品濃度高于最高標準品濃度,則應用樣品稀釋液進行稀釋
結(jié)果計算時應乘以稀釋因子
例如:
A)1:10稀釋 10ul血清+90ul樣品稀釋液(充分混勻)
B)1:100稀釋 10ul稀釋液A)1:10+90ul樣品稀釋液(充分混勻)
實驗操作
操作注意事項
1. 實驗前將所有試劑平衡至室溫,混勻,不產(chǎn)生氣泡
2. 實驗一旦開始,所有步驟必須完整的進行下去
3. 避免污染試劑,槍頭和微孔/管。每個微孔的加樣都應該用新的槍頭,避免交叉污染
4. 實驗前將所有試劑準備好,蓋子打開,所需板條固定等,這樣可以確保每個步驟間隔時間一致,無中斷。
5. 酶免反應中時間和溫度成線性關系
實驗步驟
每次檢測都應建立一標準曲線
1. 將實驗所需板條固定于板架上
2. 加50ul的標準品,質(zhì)控品和樣品于相應的孔內(nèi)
3. 每孔加50ul現(xiàn)配的酶聯(lián)物,充分混勻10秒,充分混勻這一步很重要
4. 室溫下孵育30min(無需蓋板)
5. 棄去孔內(nèi)廢液,每孔300ul的洗滌液洗板3次,吸水紙上拍干
重要提醒:洗板過程直接會影響到實驗的靈敏度和精確度
6. 每孔加50ul現(xiàn)配的底物液
7. 室溫下孵育10min
8. 加入底物液20min內(nèi)在發(fā)光光度計上讀數(shù)
結(jié)果計算
2. 在半對數(shù)坐標紙上,以標準品的RLU的均值為Y軸,濃度為X軸繪制標準曲線
3. 從標準曲線上通過RLU均值找到相對應的濃度值
4. 全自動法:自動法用最合適的4參數(shù)對數(shù)擬合法計算,它是首選計算方法,其他方法得出的結(jié)果可能會有細微的區(qū)別
5. 樣品濃度可直接從標準曲線上讀取,樣品濃度高于最高標準品濃度的則需進一步稀釋,或記錄為>50ng/ml。結(jié)果計算時要乘以稀釋因子
使用局限性
試驗中嚴格按照說明書操作和良好的實驗操作習慣可得到最優(yōu)試驗結(jié)果
任何不恰當?shù)奶幚砘蛟囼灢襟E的改動都會對結(jié)果造成影響
干擾底物
以下物質(zhì)低于下面所述濃度,其實驗結(jié)果都會不明顯
血紅蛋白 |
4mg/ml |
膽紅素 |
0.5mg/ml |
甘油三酯 |
7.5mg/ml |
試驗中含有減低HAMA和嗜異性抗體干擾作用的試劑,然而,高滴定量的HAMA和嗜異性抗體可能會對試驗結(jié)果產(chǎn)生干擾
藥物干擾
目前為止還沒有一種藥物對CYFRA 21-1檢測會產(chǎn)生影響
本譯文僅供參考,詳情請以原文為準
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