睪酮（TES）ELISA試劑盒使用說明

（德國DRG：EIA-1559）

 

1、前言

DRG公司的睪酮酶免試劑盒可用于人血清和血漿中睪酮的定量檢測。此試劑盒僅供體外診斷用。

睪酮（17β-羥基-4-雄烯-3-烷）是一種19C的類固醇激素，它在C-4和C-5間含一個不飽和鍵，C-3位置有一個酮基，C-17的β位上有一個羥基。此類固醇激素的分子量為288.47。睪酮是分泌到血液中最主要的雄性激素。在男性中，睪酮主要由睪丸的間質(zhì)細胞分泌；在女性中，處于循環(huán)中的睪酮50%來源于外周雄烯二酮的轉(zhuǎn)換，25%來源于卵巢，25%來源于腎上腺。睪酮負責男性第二性征的形成，檢測睪酮濃度有助于評價性腺機能減退的狀態(tài)。在女性中，在很多疾病中睪酮的濃度都很高，如：多毛癥，女子男性化，多囊卵巢癥，卵巢癌，腎上腺癌和腎上腺增生。而在男性中，高水平的睪酮通常與下丘腦垂體疾病、睪丸癌、先天性腎上腺增生和前列腺癌有關(guān)。在患下列疾病的病人體內(nèi)，通�？砂l(fā)現(xiàn)睪酮水平很低：垂體機能減退癥、克氏綜合征、睪丸女性化綜合征、睪丸切除術(shù)、隱睪病、酶缺陷和一些自身免疫疾病。

 

2、實驗原理

   DRG公司的睪酮酶免試劑盒是一種基于競爭法原理的固相酶免吸附實驗（ELISA）。反應(yīng)板上的微檢測孔包被有能結(jié)合睪酮分子上獨特抗原位點的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性睪酮的病人樣本與辣根過氧酶標記的睪酮競爭性的結(jié)合包被板上的抗體。溫育之后，未結(jié)合的酶聯(lián)物用洗滌液洗去。過氧酶與包被抗體的結(jié)合量與樣品中睪酮的濃度成反比。加入底物液后，所顯示的顏色強度與病人樣品中睪酮的濃度成反比。

 

3、試劑盒成份

1)      預(yù)包被反應(yīng)板，12×8孔，包被板上包被了單克隆的鼠抗睪酮抗體。

2)      標準品系列，共7支，1.0 ml/支，濃度：0；0.2；0.5；1；2；6；16ng/ml。

轉(zhuǎn)換系數(shù)：1ng/ml=3.467nmol/l。

3)      酶聯(lián)結(jié)物，1支，25ml，內(nèi)含辣根過氧酶標記的睪酮。

4)      底物/顯色劑，1支，25ml，內(nèi)含TMB。

5)      終止液，1支，0.5M的H₂SO₄ ，14ml，避免接觸終止液，以免刺激或著燒皮膚。

6)      濃縮洗滌液(40X)，1支，30ml。

注意：用于樣品稀釋的零標準品因視需要而定。

 

4、實驗所需材料（但試劑盒不提供）

1）標準移液器   2）酶標儀

3）吸水紙         4）蒸餾水

 

5、試劑盒的儲存與穩(wěn)定性

   未開啟的試劑在2—8℃下貯存時，其活性在有效期內(nèi)穩(wěn)定，不要使用過期試劑。所有開封了的試劑都必須儲存于2-8℃的環(huán)境下，微孔反應(yīng)板也必須貯存于2—8℃的環(huán)境下。一旦包裝袋被打開，必須將它小心地嚴封起來。

 

6、試劑準備

洗滌液的準備

 吸取40×濃度的洗滌液30mL用1170mL的蒸餾水混合定容至1200mL，稀釋好的洗滌液在室溫能保存2周

7、樣品

在此實驗中將用到血清或血漿（EDTA-，肝素-或檸檬酸血漿），不要使用溶血、黃疸血或脂血樣品。

請注意：含有疊氮化鈉的樣本不能使用

7.1樣品的采集

血清：靜脈穿刺采集全血，待其凝血，室溫下離心獲取血清。

血漿：將全血收集到含抗凝劑的離心試管中，采集后立即離心。

7.2樣品的儲存

實驗開始前，應(yīng)當將樣品用蓋子蓋好，2-8℃環(huán)境下可穩(wěn)定存放5天。如果實驗前想要將樣品存放更長的時間，則應(yīng)將樣品凍存于-20℃的環(huán)境下。解凍的樣品在實驗前應(yīng)反復倒置幾次。

7.3樣品的稀釋

在首次實驗時，如果血清樣品中睪酮的濃度高于最高標準品中睪酮的濃度，則應(yīng)將此樣品用零標準品稀釋10或100倍，并按實驗步驟重新檢測。在計算濃度時應(yīng)當將此稀釋因子考慮進去。

例如：

a）  按1：10的比例稀釋：10μl的血清+90μl零標準品（充分混合）

b）  按1：100的比例稀釋：10μl已稀釋好的a）+90μl零標準品（充分混合）

8、一般注意事項

1)      所有試劑和樣本在使用之前必須平衡至室溫。所有試劑必須搖勻但不能起泡沫。

2)      一旦檢測開始，所有的操作步驟必須進行到底不能中斷。

3)      為了避免交叉放映，每一標準品、質(zhì)控品和樣品的取樣都必須使用新的取樣吸頭。

4)      吸光度值是由孵育的時間和溫度所決定的。在實驗開始之前，建議準備好所有的藥劑旋開蓋子。

5)      將所需檢測的微孔板條固定在板架上等。這些準備工作將確保每次的加液步驟所需時間相同，沒有中斷。按一般的規(guī)律，酶免反應(yīng)的強度與時間和溫度成線性比例。

9、實驗步驟：

1)      將所需數(shù)量的板條固定到板架上。

2)      將標準品、質(zhì)控品和已稀釋好的樣品分別用新的取樣吸頭取25μL加入到相應(yīng)的微孔中。

3)      在每一微孔中加入200μL酶聯(lián)物。

4)      充分混勻10秒，在這個步驟完全混勻很重要。

5)      室溫孵育60分種。

6)      快速棄取孔內(nèi)反應(yīng)物，每孔用400μL洗滌液洗板3次，在吸水紙上拍干。注意：洗板步驟是否正確操作會明顯影響實驗的靈敏度和精確度。

7)      在每一微孔中加入200μl底物液。

8)      室溫孵育15分種。

9)      加100μl終止液到每個檢測孔中終止酶反應(yīng)。

10)  加終止液后10分鐘之內(nèi)，用酶標儀在450±10nm處測定OD 值。

 

10、結(jié)果計算

1)      計算每個標準品、質(zhì)控品和病人樣本的平均吸光度值。

2)      用吸光度值作為縱坐標（y），濃度值作為橫坐標（x），以每個標準品的吸光度值對其相應(yīng)的濃度值進行標繪，作一條標準曲線。

3)      用每一樣品的平均吸光度值在標準曲線上確定其相應(yīng)的濃度。

4)      自動計算方法：在IFU上，它用四參數(shù)曲線已自動計算出結(jié)果。其它的歸納方法可能會得出稍微不同的結(jié)果。

5)      樣品的濃度可直接從標準曲線上讀取。樣品中HPL濃度高于最高標準品的必須用進行進一步的稀釋。在計算樣品濃度時就應(yīng)當把此稀釋因子考慮進去。

 

11、參考值

我們強烈建議各個實驗市都建立自己的正常值和異常值。在一次明顯正常人群的研究中，我們使用DRG公司的睪酮ELISA試劑盒進行檢測得到如下結(jié)果：

人群	5%	95%
男性	2.0ng/ml	6.9ng/ml
女性	0.26ng/ml	1.22ng/ml

 

 

 

 

 

 

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。

 

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