雌二醇 (E2) ELISA試劑盒使用說明

（德國DRG：EIA2693）

1、前言說明

E2是一種含一個(gè)酚A環(huán)的18C類固醇激素。此類固醇激素的分子量為272.4，它是人體中最有效的雌激素，主要由女性卵巢的格拉芬卵泡和胎盤產(chǎn)生，少量由腎上腺和男性睪丸產(chǎn)生。E2（雌二醇）被分泌到血液中，在血液中有98%的雌二醇會(huì)結(jié)合到性激素結(jié)合蛋白上，有的還會(huì)結(jié)合到其它血清蛋白上（如血清白蛋白），只有很少一部分以游離形式存在。雌激素的活性會(huì)受到雌二醇受體符合物的影響，此符合物可在靶位并在核酸水平上引發(fā)相應(yīng)的反應(yīng)。這些靶位包括：卵泡、子宮、乳房、陰道、尿道、下丘腦、垂體和敏感稍低的肝臟與皮膚。在月經(jīng)周期正常的未懷孕女性體內(nèi)，雌二醇的分泌遵循著一種循環(huán)模式，在排卵前有兩個(gè)明顯的高峰期。高濃度的雌二醇可在垂體水平發(fā)揮正反饋?zhàn)饔�，它�?huì)影響垂體促性腺激素的分泌,如卵泡刺激素和黃體生成素，前者是卵泡成熟所必要的，后者是排卵形成所必要的。排卵后，雌二醇水平迅速下降直到黃體細(xì)胞被激活，結(jié)果雌二醇水平出現(xiàn)第二次高峰，并在黃體階段達(dá)到一平衡述評。在懷孕期間，母體血清雌二醇的水平會(huì)極度的增加，并且會(huì)超過排卵前的峰值，而且在整個(gè)孕期維持在高水平上。血清雌二醇的檢測是評價(jià)各種月經(jīng)功能障礙的一個(gè)有效指標(biāo)，例如女性早熟和晚熟，原發(fā)性、續(xù)發(fā)性閉經(jīng)和絕經(jīng)癥。據(jù)報(bào)道，女性化綜合征、男子女性型乳房和睪丸癌患者的血清雌二醇水平會(huì)升高。在不孕患者體內(nèi)，血清雌二醇的檢測有利于監(jiān)測藥物治療（如克羅米酚檸檬酸鹽、促黃體生成素釋放激素或外源性促性腺激素）后排卵的感應(yīng)情況。在因?yàn)轶w外受精而引起的卵巢過度刺激綜合征患者中，每天監(jiān)測血清雌二醇濃度以便為hCG的管理和卵母細(xì)胞的采集提供最佳時(shí)間。

2、檢測原理:

   DRG公司的雌二醇酶免試劑盒是一種基于競爭法原理的固相酶免吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）。反應(yīng)板上的微檢測孔包被有能結(jié)合雌二醇分子上獨(dú)特抗原位點(diǎn)的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性雌二醇的病人樣本與辣根過氧酶標(biāo)記的雌二醇競爭性的結(jié)合包被板上的抗體。溫育之后，未結(jié)合的酶聯(lián)物用洗滌液洗去。過氧酶與包被抗體的結(jié)合量與樣品中雌二醇的濃度成反比。加入底物液后，所顯示的顏色強(qiáng)度與病人樣品中雌二醇的濃度成反比。

3、試劑盒成分:

1)       包被板，12×8（可拆），96孔，微孔中包被了抗雌二醇的兔單克隆抗體。

2)       標(biāo)準(zhǔn)品：7支1.0ml/支。分別含量為：0；25；100；250；500；1000；2000pg/ml。 (1pg/ml=3.67pmol/L)

3)       酶聯(lián)結(jié)物：1支，25 ml，內(nèi)含辣根過氧化物酶標(biāo)記的雌二醇。

4)       底物液：1支，內(nèi)含，14ml ，內(nèi)含TMB

5)       終止液：1支，0.5M的 H₂SO₄，14ml，避免接觸終止液，以免造成刺激皮膚和著燒皮膚。

6)       洗滌液(40×)，1支，30ml

注：用于樣品稀釋的零標(biāo)準(zhǔn)品視需要而定。

4、實(shí)驗(yàn)需要器材（但試劑盒不提供）

1)        酶標(biāo)儀(450±10nm)。

2)        微量移液器和吸嘴 25μl、100μl、200μl。

3)        坐標(biāo)紙。

4)        去離子水。

5、試劑貯存:

   未開啟的試劑在2—8℃下貯存時(shí)，其活性在有效期內(nèi)穩(wěn)定，不要使用過期試劑。所有開封了的試劑都必須儲(chǔ)存于2-8℃的環(huán)境下，微孔反應(yīng)板也必須貯存于2—8℃的環(huán)境下。一旦包裝袋被打開，必須將它小心地嚴(yán)封起來。

6、試劑準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)開始前，將所有的試劑和所需數(shù)目的板條都平衡至室溫。

洗滌液：在30ml的濃縮洗滌液中加入1170ml去離子水進(jìn)行稀釋，稀釋好的洗滌液室溫下可穩(wěn)定存放2周。

7、樣本采集和準(zhǔn)備

7.1樣品的采集

血清：靜脈穿刺采集全血，待其凝血，室溫下離心獲取血清。

血漿：將全血收集到含抗凝劑的離心試管中，采集后立即離心。

7.2樣品的儲(chǔ)存

實(shí)驗(yàn)開始前，應(yīng)當(dāng)將樣品用蓋子蓋好，2-8℃環(huán)境下可穩(wěn)定存放5天。如果實(shí)驗(yàn)前想要將樣品存放更長的時(shí)間，則應(yīng)將樣品凍存于-20℃的環(huán)境下。解凍的樣品在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)反復(fù)倒置幾次。

7.3樣品的稀釋

在首次實(shí)驗(yàn)時(shí)，如果血清樣品中睪酮的濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品中睪酮的濃度，則應(yīng)將此樣品用零標(biāo)準(zhǔn)品稀釋10或100倍，并按實(shí)驗(yàn)步驟重新檢測。在計(jì)算濃度時(shí)應(yīng)當(dāng)將此稀釋因子考慮進(jìn)去。

例如：

a）  按1：10的比例稀釋：10μl的血清+90μl零標(biāo)準(zhǔn)品（充分混合）

b）  按1：100的比例稀釋：10μl已稀釋好的a）+90μl零標(biāo)準(zhǔn)品（充分混合）

8、實(shí)驗(yàn)步驟:

所有的標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和質(zhì)控品都做雙份檢測以保證所有的檢測條件都相同。

1)       將所需數(shù)量的板條固定到板架上。

2)       將標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和已稀釋好的樣品分別用新的取樣吸頭取25μL加入到相應(yīng)的微孔中。

3)       在每一微孔中加入200μL酶聯(lián)物。

4)       充分混勻10秒，在這個(gè)步驟完全混勻很重要。

5)       室溫孵育120分種。

6)       快速棄去孔內(nèi)反應(yīng)物，每孔用400μL洗滌液洗板3次，在吸水紙上拍干。注意：洗板步驟是否正確操作會(huì)明顯影響實(shí)驗(yàn)的靈敏度和精確度。

7)       在每一微孔中加入100μl底物液。

8)       室溫孵育15分種。

9)        加50μl終止液到每個(gè)檢測孔中終止酶反應(yīng)。

10)     加終止液后10分鐘之內(nèi)，用酶標(biāo)儀在450±10nm處測定OD 值。

9、結(jié)果計(jì)算:

1)       計(jì)算每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和病人樣本的平均吸光度值。

2)       用吸光度值作為縱坐標(biāo)（y），濃度值作為橫坐標(biāo)（x），以每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值對其相應(yīng)的濃度值進(jìn)行標(biāo)繪，作一標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3)       用每一樣品的平均吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上確定其相應(yīng)的濃度。

4)        自動(dòng)計(jì)算方法：在IFU上，它用四參數(shù)曲線已自動(dòng)計(jì)算出結(jié)果。其它的歸納方法可能會(huì)得出稍微不同的結(jié)果。

5)        樣品的濃度可直接從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取。樣品中HPL濃度高于最高標(biāo)準(zhǔn)品的必須用進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋。在計(jì)算樣品濃度時(shí)就應(yīng)當(dāng)把此稀釋因子考慮進(jìn)去。

10、參考值

我們強(qiáng)烈建議各個(gè)實(shí)驗(yàn)市都建立自己的正常值和異常值。在一明顯正常人群的研究中，我們使用DRG公司的雌二醇ELISA試劑盒進(jìn)行檢測得到如下結(jié)果：

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準(zhǔn)。

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