胰島素ELISA試劑盒使用說明

（德國DRG：EIA2935）

1、前言說明

DRG公司的胰島素酶免試劑盒可用于人血清和血漿中（加入了肝素或檸檬酸的血漿）胰島素的定量檢測。此檢測試劑盒僅供體外診斷用。

胰島素是調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的主要激素，它由朗格漢氏小島的β細胞合成分泌，并以前胰島素的前體形式存在，前胰島素可加工形成C肽和胰島素。這兩種激素都以等量形式分泌到門脈循環(huán)中。成熟的胰島素分子由兩條多肽鏈組成，A鏈和B鏈（分別21個和30個氨基酸）。這兩條鏈通過鍵內(nèi)二硫鍵而連接到一起。胰島素的分泌主要受血漿葡萄糖濃度的影響，這種激素有一系列重要的代謝功能。它的主要功能是通過葡萄糖的運送來控制外周組織中葡萄糖的攝取和利用。胰島素和其它低血糖激素的作用（如抑制肝糖原的異生和糖原分解）可被高血糖激素（胰高血糖素，腎上腺素，生長激素和皮質(zhì)醇）的作用中和掉。在胰島素依賴性的糖尿病（IDDM）和其它疾病例如垂體機能減退疾病中,胰島素的濃度會明顯降低。在非胰島素依賴性的糖尿病患者、肥胖患者、胰島素瘤患者和一些內(nèi)分泌功能紊亂（如庫欣綜合癥和支端肥大癥）患者的體內(nèi)，其胰島素的水平會上升。

2、實驗原理

DRG公司的胰島素酶免實驗是一種基于夾心法原理的固相酶聯(lián)免吸附實驗(ELISA),反應(yīng)板上的微檢測孔包被有能結(jié)合胰島素分子上獨特抗原位點的單克隆抗體。一份含有內(nèi)源性胰島素的病人樣本在包被孔中與酶聯(lián)物進行孵育，該酶聯(lián)物是一種生物素標記的抗胰島素抗體。孵育后，用洗滌液洗去未結(jié)合的酶聯(lián)物。在第二次溫育時，鏈親和素過氧酶復(fù)合物結(jié)合到生物素化抗胰島素抗體上，過氧酶復(fù)合物的結(jié)合量與樣品中胰島素的濃度成正比。加入底物液后，所顯示的顏色強度與病人樣品中胰島素的濃度成正比。

3、試劑盒成分

1)       微孔板：12×8，96孔，包被抗胰島素的單克隆抗體。

2)       零標準品 ：1支，3ml，即用，0μIU/ml。

3)       標準品1－5：5支，1ml，即用，6.25;12.5;25;50;100μlU/ml。

4)       酶聯(lián)物：1支，5ml，即用，生物素化的鼠單克隆抗體。

5)       酶復(fù)合物：1支，7ml，即用，辣根過氧化物-鏈親和素復(fù)合物。

6)       TMB底物液：1支 14ml 即用。

7)       終止液： 1支 14ml 即用 包含0.5M硫酸,請勿接觸終止液，以免刺激或著燒皮膚。

8)       洗滌液：1瓶，30ml，40倍濃縮，見試劑準備。

注意：用樣品稀釋的零標準品視需要而定。

4、實驗所需材料（但試劑盒不提供）

1）  酶標儀

2）  標準移液器

3）  吸水紙

4）  蒸餾水

5、試劑的儲存與穩(wěn)定性

所有的未開啟的試劑在2－8℃下儲存至保質(zhì)期，不要使用過期的試劑。所有開啟的試劑應(yīng)在2－8℃下儲存。一旦打開微孔板的包裝，需將其重新密封。

 

6、樣品的準備

將所有的試劑和所需要的板條在使用前平衡至室溫。

洗滌液：用1170ml的蒸餾水稀釋30ml濃縮的洗滌液，最終得到的容積為1200ml，稀釋好的洗滌液在室溫下可穩(wěn)定存放兩個星期。

 

7、樣品的收集

此ELISA試劑盒可使用血清也可使用（只有肝素或檸檬酸鹽抗凝的血漿）血漿作為樣品。

不能使用明顯溶血﹑黃疸和脂血的樣品。

血清：靜脈穿刺采集全血，待其凝血，在室溫下離心分離血清。

血漿：將全血采集到含有抗凝劑的離心管，采集后立即離心分離。

8、樣品的儲存：

樣品蓋好蓋子后，可在實驗前2-8℃下儲存5天，要更長時間儲存，應(yīng)在-20℃下凍存。在開始實驗前應(yīng)避免反復(fù)凍融樣品。

 

9、樣品的稀釋：

在第一次實驗中，要是樣品的濃度高于最高標準品，則樣品應(yīng)用按實驗步驟所描述的10倍或100倍稀釋。在計算濃度時需乘以此稀釋度。

例子：

a）  按1：10稀釋： 10μL的血清+90μL的零標準品（充分搖勻）。

b）  按1：100釋�。�10μL按a）稀釋的血清+90μL的零標準品（充分搖勻）

 

10、實驗步驟

所有的標準品、質(zhì)控品和樣品都必須做雙份檢測以確保所有微孔的檢測條件都一樣。

1）將所需數(shù)目的板條置于板架上。。

2）用一次性吸嘴將標準品﹑質(zhì)控品和樣品分別25μL加入相應(yīng)的檢測孔中。

3）每孔加入25μL的酶聯(lián)物。

4）充分混合10秒，在此步驟中充分混合非常重要。

5）室溫下溫育30分鐘。

6）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物，每孔加入400μL的洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。注意：洗板步驟是否正確操作會明顯影響實驗的靈敏度和精確度。

7）每孔加入50μL的酶復(fù)合物。

8）在室溫下溫育30分鐘。

9）快速棄去檢測孔中的內(nèi)含物，每孔加入400μL的洗滌液洗板三次，在吸水紙上拍干以除去殘余液體。

10）每孔加入50μL的底物液。

11）在室溫下溫育15分鐘。

12）每孔加入50μL的終止液終止反應(yīng)。

13）在加終止液后10分鐘內(nèi)于450±10nm處讀取OD值。

 

11、計算結(jié)果：

1)     計算標準品﹑質(zhì)控品和病人樣品的平均吸光度。

2)     以吸光率為Y軸，濃度為X軸，按照從標準品中獲得的平均吸光率和其相對應(yīng)的濃度值，繪制一條標準曲線。

3)     利用樣品的平均吸光率，在標準曲線上得出其相應(yīng)的濃度值，

4)     自動方法：使用計算機三次方模式﹑四參數(shù)模式或雙對數(shù)函數(shù)的計算機程序可得到結(jié)果。

5)     樣品的濃度可從標準曲線上直接獲取。樣品的濃度高于最高標準品的濃度則需進一步稀釋。在計算濃度的時候，要乘以樣品的稀釋倍數(shù)。

下面是胰島素ELISA的標準曲線的典型例子。

標準品	吸光率（450nm）
零標準品（0 μIU/ml）	0.03
標準品1（6.25 μIU/ml）	0.07
標準品2（12.5 μIU/ml）	0.14
標準品3（25 μIU/ml）	0.35
標準品4（50 μIU/ml）	0.88
標準品5（100 μIU/ml）	2.05

 

參考值：

建議各實驗室建立自己的正常值與非正常值。

在一明顯正常成年人的研究中，用DRG公司的胰島素ELISA試劑盒進行檢測得到如下數(shù)值：2-25μIU/ml

 

 

 

 

 

 

 

本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。

 

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