脂質(zhì)納米顆粒(LNPs)作為核酸遞送的多功能納米載體，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，包括癌癥免疫療法、代謝調(diào)節(jié)和預(yù)防性疫苗等方面。典型的LNPs配方由可電離的陽離子脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)、膽固醇和聚乙二醇(PEG)四種脂質(zhì)組成，這些成分在穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)、包封效率以及體內(nèi)外相互作用中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。負(fù)載了核酸的LNPs的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和表面形態(tài)會(huì)隨著脂質(zhì)成分的不同而產(chǎn)生變化，從而影響終產(chǎn)品的穩(wěn)定性和治療效果。

為了提高核酸遞送的效率，研究者已經(jīng)開發(fā)了多種先進(jìn)技術(shù)對裝載核酸的LNPs進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，其中小角中子散射(small angle neutron scattering, SANS)通過氫和氘的中子散射長度密度差異可以揭示mRNA-LNPs中的脂質(zhì)分布。然而，以往的SANS分析往往基于一個(gè)理想化的假設(shè)——即LNPs內(nèi)的mRNA是均勻分布的，卻忽視了可能存在空載LNPs的情況。此外，最近有研究表明，通過商業(yè)微流控技術(shù)制備的mRNA-LNPs樣品中可能混有空載的LNPs。這一發(fā)現(xiàn)對SANS的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)可靠性提出了挑戰(zhàn)，并提示我們需要對SANS的結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行重新評估。

近日，來自上海交通大學(xué)的團(tuán)隊(duì)在bioRxiv平臺(tái)發(fā)布了一篇題為“Structural Characterization of mRNA Lipid Nanoparticles in the Presence of Intrinsic Drug-free Lipid Nanoparticles”的文章，通過結(jié)合SANS和納米流式檢測技術(shù)(NanoFCM)，開發(fā)了一種在空載LNPs存在的情況下表征mRNA-LNPs結(jié)構(gòu)的方法，這對于mRNA-LNPs的機(jī)制研究和質(zhì)量評估具有重要意義。

一、空載LNP和mRNA-LNP樣品的基本表征
研究人員采用Moderna開發(fā)的COVID-19 mRNA疫苗的脂質(zhì)配方，通過包裹長度為2856 nt的mRNA制備mRNA-LNPs，并用相同的配方制備了空載的LNPs作為對照。粒徑分析結(jié)果顯示，mRNA-LNPs的粒徑相較于空載LNPs有所增大(圖1a)。此外，冷凍電子顯微鏡(cryo-EM)結(jié)果顯示，空載LNP和mRNA-LNP樣品均呈現(xiàn)出皰疹樣形態(tài)，即近似球形但不規(guī)則的結(jié)構(gòu)，且具有明顯的電子密度分區(qū)(圖1b)。為深入研究mRNA-LNPs的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，作者進(jìn)一步使用小角度X射線散射(small angle X-ray scattering, SAXS)表征兩種樣品。SAXS曲線顯示，mRNA-LNPs相較于空載LNPs在q~0.13 Å-1處多了一個(gè)峰(圖1c)，這個(gè)結(jié)果與早前的研究吻合，即mRNA分子嵌入脂質(zhì)復(fù)合物后會(huì)在q~0.1 Å-1處產(chǎn)生一個(gè)特征峰。另外，SAXS數(shù)據(jù)沒有發(fā)現(xiàn)mRNA水溶液的特征峰，證明本研究的mRNA-LNPs中存在脂質(zhì)-mRNA混合物。結(jié)合以上結(jié)果，作者提出了mRNA-LNPs由水相和含有mRNA的脂質(zhì)相組成的模型，這個(gè)結(jié)構(gòu)模型與其它研究不同，大多數(shù)研究者認(rèn)為皰疹狀形態(tài)是由包含mRNA的水相和脂質(zhì)相構(gòu)成的。最后，作者評估了兩種樣品的包封率和體外轉(zhuǎn)染效力(圖1d、1e)，進(jìn)一步證實(shí)了該LNP配方的高質(zhì)量和有效性。
 

圖1. 空載LNP和mRNA-LNP樣品的基本表征

二、空載LNPs的結(jié)構(gòu)表征
LNPs在mRNA疫苗中具有雙重作用，既可作為增強(qiáng)免疫效果的佐劑，又可能成為免疫原引發(fā)不良反應(yīng)。因此，在空載LNPs顯著存在的情況下，了解LNPs的結(jié)構(gòu)對于闡明mRNA疫苗的藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布至關(guān)重要。作者采用超小角中子散射(very small angle neutron scattering, VSANS)技術(shù)來表征空載LNPs的結(jié)構(gòu)，將空載LNP樣品懸浮在不同比例的D2O/H2O溶劑中(圖2a)，收集VSANS數(shù)據(jù)，確定LNP核心和殼層內(nèi)的脂質(zhì)分布。根據(jù)VSANS數(shù)據(jù)擬合結(jié)果，提出了空載LNPs的核心-殼層結(jié)構(gòu)模型(圖2b），詳細(xì)確定了核心和殼層的體積分?jǐn)?shù)、溶劑含量及脂質(zhì)組成等參數(shù)。
 

圖2. VSANS對空載LNPs的結(jié)構(gòu)表征

三、NanoFCM檢測空載LNPs的比例
為獲得mRNA-LNPs的結(jié)構(gòu)信息，首先需要確定mRNA-LNP樣品中空載LNPs的占比。對此，作者利用NanoFCM在單個(gè)納米顆粒水平上對LNPs進(jìn)行表征。通過核酸染料標(biāo)記，可在mRNA-LNP樣品中同時(shí)觀察到側(cè)向散射和熒光信號，而在空載LNPs中僅檢測到側(cè)向散射信號。根據(jù)信號數(shù)量可分析mRNA-LNP樣品中空載LNPs的比例，結(jié)果為27.6±2.9%(圖3a)。此外，通過納米流式的熒光定量分析功能計(jì)算出mRNA-LNPs的平均負(fù)載為2.9±0.1個(gè)mRNA分子(圖3b)。需要注意的是，每個(gè)LNP中封裝的核酸分子數(shù)量與其長度高度相關(guān)。對于包封較短的siRNA的LNPs，每個(gè)LNP可以封裝數(shù)百個(gè)siRNA分子。而對于mRNA，當(dāng)長度超過2,000個(gè)核苷酸時(shí)，推測每個(gè)LNP中封裝的mRNA分子數(shù)量將少于三個(gè)。這些結(jié)果為理解mRNA-LNPs的組成和結(jié)構(gòu)特征提供了重要的信息，有助于進(jìn)一步優(yōu)化其在基因治療和疫苗開發(fā)中的應(yīng)用。通過精確測定空載LNPs的比例和mRNA的負(fù)載，我們也能夠更好地評估LNPs的制備工藝和其生物學(xué)性能。
 

圖3. 通過NanoFCM檢測LNPs的滿殼率和mRNA拷貝數(shù)

四、mRNA-LNPs的結(jié)構(gòu)表征
基于NanoFCM分析得到的信息，從混合樣本的SANS數(shù)據(jù)中扣除空載LNPs的貢獻(xiàn)后，得到了純mRNA-LNPs的結(jié)構(gòu)信息。結(jié)果顯示，mRNA-LNPs的脂質(zhì)分布、殼層厚度與空載LNPs相似，但溶劑含量更高，導(dǎo)致核心尺寸更大。此外，分析得出，每個(gè)mRNA-LNP中平均含有3.2±0.2個(gè)mRNA分子，這與NanoFCM測定結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了結(jié)構(gòu)模型的準(zhǔn)確性�；�于以上結(jié)果，作者提出了mRNA-LNPs的精確模型（圖4）。
 

圖4. 根據(jù) VSANS 擬合結(jié)果提出的 mRNA-LNPs 結(jié)構(gòu)模型

研究意義
本文深入研究了mRNA-LNPs的結(jié)構(gòu)，揭示了空載LNPs在樣品中的占比及其對結(jié)構(gòu)表征的影響，糾正了以往研究中可能存在的結(jié)構(gòu)模型偏差。通過結(jié)合NanoFCM和SANS技術(shù)，精確地表征了mRNA-LNPs的結(jié)構(gòu)，為深入探究其組裝機(jī)制、穩(wěn)定性及與生物分子的相互作用提供了重要信息。這些研究成果有助于優(yōu)化LNP的脂質(zhì)配方和制備工藝，提高mRNA的包封效率和細(xì)胞內(nèi)遞送效率，增強(qiáng)疫苗的免疫原性與安全性，降低潛在的不良反應(yīng)，從而加速mRNA疫苗的開發(fā)和應(yīng)用。同時(shí)，對mRNA-LNPs結(jié)構(gòu)的深入理解也為基因治療領(lǐng)域提供了新的思路，有助于提高基因遞送效率，拓展應(yīng)用范圍，促進(jìn)納米醫(yī)學(xué)的發(fā)展，為設(shè)計(jì)更有效的納米藥物載體提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

展望
隨著核酸納米藥物產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，空載LNPs占比（即空殼率）已逐漸成為其工藝開發(fā)和質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標(biāo)。對此，NanoFCM提供了一種快速、高效、高靈敏的解決方案，可在單個(gè)LNP水平快速獲得樣品的粒徑分布、顆粒濃度、空殼率、包封率和單個(gè)LNP載荷（核酸拷貝數(shù)）等信息。如有興趣進(jìn)一步了解，歡迎聯(lián)系我們獲取詳細(xì)解決方案。