細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)作為細(xì)胞間通訊的重要媒介，具有優(yōu)異的生物相容性、低免疫原性和組織趨向性，在心血管疾病、自身免疫綜合征、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等在內(nèi)的多種疾病研究中展示出應(yīng)用潛力。然而，諸如缺乏低成本、自動化、大規(guī)模制備的方法等因素，嚴(yán)重限制了EVs的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。

近期，來自天津大學(xué)、中科院化學(xué)所和浙江腫瘤醫(yī)院的研究人員開發(fā)了一種大量制備脫水誘導(dǎo)細(xì)胞外囊泡(dehydration-induced extracellular vesicles, DIMVs)的新方法。該方法無需引入潛在的有毒物質(zhì)，在30 min內(nèi)即可大量制備DIMVs，具有快速、通用、可實現(xiàn)EVs規(guī)模化制備等優(yōu)勢，進(jìn)一步對DIMVs的免疫原性及安全性、抑制腫瘤形成和復(fù)發(fā)能力及其在藥物遞送研究中的應(yīng)用潛力進(jìn)行探究。該成果發(fā)表在Journal of Extracellular Vesicles上。
 

一、DIMVs的制備與表征
作者通過脫水方式代替其他物理和化學(xué)方法以刺激細(xì)胞釋放更多的囊泡。如圖1所示，對經(jīng)PBS洗滌后的細(xì)胞進(jìn)行短時間脫水處理(20 min)，隨后對脫水處理的細(xì)胞通過再水化過程，即分別添加PBS和培養(yǎng)基，在30 min內(nèi)處理后細(xì)胞大量分泌微米級DIMVs，采用簡單離心即可從上清液中收獲DIMVs。作者進(jìn)一步應(yīng)用轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白的HEK293T和PC9細(xì)胞在熒光顯微鏡下監(jiān)測DIMVs的形成過程，驗證了DIMVs的發(fā)芽，膨脹和脫離行為。

結(jié)合顯微成像和流式細(xì)胞術(shù)等分析方法，作者進(jìn)一步確認(rèn)了DIMVs是一類具有生物膜結(jié)構(gòu)的微米級囊泡(2~40 mm)，且在4 ℃條件下可穩(wěn)定保存7天。在最佳制備條件下，每個細(xì)胞平均可產(chǎn)生20個DIMVs。每100萬個細(xì)胞中所得DIMVs的蛋白含量可達(dá)57 mg，是相同培養(yǎng)條件下所得sEVs的580倍，在蛋白質(zhì)利用方面具有顯著優(yōu)勢。
 

圖1. DIMVs的制備流程示意圖

二、DIMVs與親本細(xì)胞和相同來源sEVs的組分差異
作者進(jìn)一步對DIMVs、sEVs和親本細(xì)胞的組分進(jìn)行分析，以表征三者在蛋白、DNA和RNA組分方面的差異（圖2）。SDS-PAGE和定量蛋白質(zhì)譜結(jié)果均顯示DIMVs的蛋白質(zhì)組與親本細(xì)胞更為相似；而WB結(jié)果則顯示DIMVs具有sEVs經(jīng)典標(biāo)志蛋白CD9、CD63和CD81的同時，也具有sEVs的陰性蛋白calnexin與GM130。這些數(shù)據(jù)表明DIMVs很可能兼具了sEVs和細(xì)胞蛋白組成的雙重特征。DNA分析結(jié)果則顯示DIMVs和sEVs中均不存在完整的基因組片段，且DIMVs中DNA含量最低，可以有效避免下游應(yīng)用中cGAS-STING信號通路的激活；RNA分析結(jié)果則顯示sEVs中的RNA含量最低，且基本均為短片段，而DIMVs則顯示出最高的RNA含量，并且能夠有效地裝載長片段RNA，對于有效遞送治療性長片段RNA具有天然優(yōu)勢。
 

圖2. DIMVs、sEVs及其親本PC9細(xì)胞的組分比較

三、利用DIMVs制備類sEVs顆粒
不同大小的囊泡在體內(nèi)具有不同的組織分布和代謝特征，因此調(diào)整囊泡的大小以適應(yīng)各種臨床需求至關(guān)重要。在此，作者配合使用微型擠出器和微尺度過濾技術(shù)，以生產(chǎn)制備類sEVs顆粒。即將DIMVs連續(xù)擠壓通過1、0.4和0.1 μm的濾膜，將其制備為粒徑50~200 nm的小囊泡（圖3）。該方法所得類sEVs的產(chǎn)量明顯優(yōu)于從細(xì)胞培養(yǎng)上清中所得sEVs的產(chǎn)量，其顆粒數(shù)量增加50倍，且該類sEVs在沒有冷凍保存劑的條件下，可穩(wěn)定凍存于-80 ℃下。在細(xì)胞攝取實驗中，類sEVs和sEVs顯示出相當(dāng)?shù)娜苊阁w定位和細(xì)胞攝取能力，即表明這兩種類型的顆�？赡芾�用相同的細(xì)胞攝取途徑。
 

圖3. 基于DIMVs的類sEVs的制備、表征及細(xì)胞攝取能力考察

四、DIMVs蛋白工程化及核酸藥物裝載
蛋白組數(shù)據(jù)顯示DIMVs可以從親本細(xì)胞中繼承絕大多數(shù)的非細(xì)胞核蛋白，因此，在DIMVs中蛋白工程化中很可能不需要通過與支架蛋白融合來產(chǎn)生特定蛋白的裝載。為了進(jìn)一步驗證該猜想，作者分別在親本細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)以及細(xì)胞內(nèi)膜蛋白mScarlet-I上分別表達(dá)GFP熒光蛋白，并采用共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)對所得DIMVs進(jìn)行表征。流式結(jié)果顯示三種轉(zhuǎn)染細(xì)胞所得DIMVs中約40%有GFP熒光蛋白信號，且共聚焦顯微鏡揭示了DIMVs的靶蛋白繼承了其在親本細(xì)胞中的定位特征。因此，在基因工程方面，DIMVs有效地規(guī)避了當(dāng)前sEVs基因修飾過程的局限性。

納米流式結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)由來源于細(xì)胞膜表達(dá)GFP親本細(xì)胞來源的DIMVs制備的類sEVs中表達(dá)目標(biāo)蛋白GFP的比例為30.8%，遠(yuǎn)高于細(xì)胞分泌的sEVs 5.13%的陽性率（圖4d）。綜合結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的sEVs相比，DIMVs的蛋白貨物在基因工程化改造方面具有天然優(yōu)勢。

作者進(jìn)一步考察了DIMVs在核酸遞送中的能力。之前已有文章報道，可采用末端修飾膽固醇的方式將目標(biāo)核酸錨定在細(xì)胞膜上，進(jìn)一步實現(xiàn)分離囊泡內(nèi)膜的核酸修飾。因此，作者評估了在膽固醇修飾與否兩種情況下DIMVs的DNA裝載能力（圖4e）。無論膽固醇修飾與否，DIMVs都能有效地裝載目標(biāo)核酸分子，效率可達(dá)100%（圖4f）；含有固醇的DNA分子主要集中在DIMVs的脂膜上，而不含固醇的DNA分子則集中在DIMVs內(nèi)腔（圖4g）；且降低培養(yǎng)溫度可顯著降低無膽固醇DNA在DIMVs中的富集比例和富集強度（圖4h）。且納米流式檢測技術(shù)分析結(jié)果表明固醇轉(zhuǎn)載DNA的DIMVs所得類sEVs中成功裝載目標(biāo)核酸的比例可達(dá)41.3%。

綜上，無論是DIMVs或者基于DIMVs所得的類sEVs在高效裝載蛋白和核酸方面均具有巨大潛力。
 

圖4. DIMVs作為蛋白和核酸遞送載體分析

此外，作者也通過小鼠體內(nèi)實驗對DIMVs的安全性進(jìn)行評估。體內(nèi)成像分布顯示DIMVs在小鼠體內(nèi)對腫瘤具有較好的歸巢效應(yīng)，能在腫瘤部位進(jìn)行有效富集；同時，作者還探討了DIMVs在B16黑色素瘤的形成和復(fù)發(fā)中的抑制效果，以及其作為腫瘤疫苗的應(yīng)用潛力。

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