DRIP-seq揭示AMPK通過R-loop形成以維持基因組穩(wěn)定和生殖細(xì)胞完整
在饑餓等能量脅迫條件下，生物體會通過調(diào)整基因表達(dá)和代謝來適應(yīng)。AMPK（AMP激活蛋白激酶）是一種高度保守的代謝主調(diào)控因子，能夠感知能量水平的降低，并在饑餓等應(yīng)激條件下合理分配能量。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C. elegans）在胚胎發(fā)育結(jié)束后，如果營養(yǎng)充足則繼續(xù)發(fā)育；如果缺乏食物，則進(jìn)入一種靜止的非發(fā)育狀態(tài)（L1滯育期），細(xì)胞分裂暫停，轉(zhuǎn)錄和翻譯維持在最低水平。研究者之前發(fā)現(xiàn)，缺乏AMPK的線蟲在從急性饑餓中恢復(fù)后，會出現(xiàn)生殖缺陷，且這些缺陷會傳遞到未經(jīng)歷饑餓的后代中。那么秀麗隱桿線蟲在饑餓條件下，AMPK缺失是如何導(dǎo)致表觀遺傳修飾異常、基因組不穩(wěn)定性以及生殖缺陷的呢？
近日，加拿大麥吉爾大學(xué)生物系Bing Sun、McLean Sherrin、Richard Roy揭示了AMPK缺失導(dǎo)致的異常表觀遺傳修飾（特別是組蛋白H3K4me3的異常沉積）如何通過形成異常的R-loop結(jié)構(gòu)（RNA-DNA雜合體）影響基因組穩(wěn)定性，并導(dǎo)致生殖缺陷。還探討了這些表觀遺傳修飾和R-loop的跨代遺傳性，以及它們對生殖細(xì)胞完整性和DNA損傷響應(yīng)的影響。相關(guān)研究成果以“Unscheduled epigenetic modifications cause genome instability and sterility through aberrant R-loops following starvation”為題發(fā)表于《Nucleic Acids Research》（NAR）期刊。
標(biāo)題：Unscheduled epigenetic modifications cause genome instability and sterility through aberrant R-loops following starvation（饑餓后，異常的的表觀遺傳修飾通過異常的R-loop結(jié)構(gòu)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性和不育）
發(fā)表時(shí)間：2023-1-11
發(fā)表期刊：Nucleic Acids Research
影響因子：IF 16.6 / 1區(qū)
技術(shù)平臺：ChIP-seq、DRIP-seq
在饑餓期間，生物體會調(diào)整基因表達(dá)和代謝以適應(yīng)能量脅迫。作者先前研究表明，AMP激活蛋白激酶（AMPK）缺乏的秀麗隱桿線蟲在從急性饑餓中恢復(fù)后，其生殖細(xì)胞中組蛋白H3在第4位賴氨酸上三甲基化（H3K4me3）水平異常升高，并表現(xiàn)出跨代生殖缺陷。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這些H3K4me3修飾在啟動(dòng)子區(qū)域顯著增加，驅(qū)動(dòng)異常的轉(zhuǎn)錄延伸，導(dǎo)致饑餓的AMPK突變體中R-loop結(jié)構(gòu)積累。
作者通過DNA-RNA免疫沉淀高通量測序（DRIP-seq）分析發(fā)現(xiàn)基因組中有相當(dāng)一部分區(qū)域受R-loop形成影響，尤其在染色質(zhì)被H3K4me3修飾的基因啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域影響最為顯著。與H3K4me3類似，R-loop也具有可遺傳性，可能促進(jìn)了這些突變體在饑餓后典型的跨代生殖缺陷。此外，AMPK突變體的生殖細(xì)胞在R-loop形成位點(diǎn)顯示出顯著更多的RAD-51（一種RecA類重組酶）焦點(diǎn)，這可能會限制它們在減數(shù)分裂斷裂或誘導(dǎo)性DNA損傷位點(diǎn)的正常功能。
本研究揭示了AMPK在饑餓后維持基因組穩(wěn)定性中的重要作用。R-loop對DNA損傷敏感性和生殖干細(xì)胞完整性的下游影響，可能解釋了在許多人類疾�。òǜ鞣N癌癥）中發(fā)生的異常表觀遺傳修飾。
研究方法
實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?/strong>使用秀麗隱桿線蟲（C. elegans），特別是缺乏AMPK的突變體（aak-1/2）。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：將線蟲置于饑餓條件下（M9緩沖液中3天），然后恢復(fù)營養(yǎng)供應(yīng)，觀察其生殖和基因組變化。
技術(shù)手段：
ChIP-seq（染色質(zhì)免疫沉淀測序）：用于分析H3K4me3在基因組中的分布。
DRIP-seq（DNA-RNA免疫沉淀測序）：用于檢測R-loop的形成和分布。
免疫熒光：檢測R-loop和RAD-51（一種DNA修復(fù)蛋白）的定位。
藥物處理和基因過表達(dá)：通過抑制轉(zhuǎn)錄延伸或過表達(dá)RNH-1（RNA酶H同源物）來研究R-loop的形成機(jī)制。
基因表達(dá)分析：通過4sU標(biāo)記和qPCR驗(yàn)證R-loop的形成與轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)系。
關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)
（1）H3K4me3的異常沉積
在饑餓條件下，AMPK缺失的線蟲中，H3K4me3在基因啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）區(qū)域顯著增加，這種異常沉積可跨代遺傳。此外，這些異常的H3K4me3位點(diǎn)與RNA聚合酶II（Pol II）的轉(zhuǎn)錄延伸活性相關(guān)，表明它們可能激活了本應(yīng)沉默的基因。
圖1. 饑餓的AMPK突變體后代中，異常的H3K4me3沉積主要發(fā)生在TSS區(qū)域。
A. H3K4me3 ChIP-seq分析的樣本收集方案。 P0代L1滯育期動(dòng)物在M9緩沖液中饑餓3天，隨后讓幼蟲進(jìn)食直至收集F2代成蟲。
B. H3K4me3 ChIP-seq信號在rps-20、orc-5、tlf-1、mdt-18和rpb-10基因的啟動(dòng)子-TSS區(qū)域的基因組瀏覽器快照。綠條表示啟動(dòng)子-TSS區(qū)域的H3K4me3信號peaks。軌跡高度代表測序reads數(shù)。
C. 野生型（WT）與AMPK突變體在TSS處的H3K4me3信號的線性軌跡。
D. WT和aak-1/2動(dòng)物在TSS處的H3K4me3信號的k均值聚類熱圖。
E. H3K4me3 peaks的注釋和定位分析。 分析了比對到啟動(dòng)子-TSS、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)（TTS）、外顯子和其他區(qū)域的H3K4me3 peaks。在aak-1/2突變體中，peaks主要累積在啟動(dòng)子-TSS區(qū)域。
F. 饑餓的AMPK突變體中異常的H3K4me3位點(diǎn)參與轉(zhuǎn)錄。 在L1滯育后的野生型（N2）和AMPK突變體F2成蟲中進(jìn)行抗H3K4me3的ChIP實(shí)驗(yàn)。
G. 饑餓的AMPK突變體中活躍轉(zhuǎn)錄水平更高。 使用4sU標(biāo)記法評估饑餓的AMPK突變體L1幼蟲的F2代后代中的活躍轉(zhuǎn)錄，同時(shí)處理的野生型對照組也進(jìn)行了類似分析（左圖）。在10分鐘脈沖標(biāo)記后評估并定量了4sU的摻入率（右圖）。
（2）R-loop的形成與積累：
在饑餓條件下，AMPK缺失的線蟲生殖細(xì)胞中R-loop顯著增加，尤其是在啟動(dòng)子-TSS區(qū)域。R-loop的形成與H3K4me3的異常沉積相關(guān)，且這種R-loop增加可以傳遞到后代中。通過RNH-1過表達(dá)或抑制轉(zhuǎn)錄延伸，可以減少R-loop的形成，并部分恢復(fù)線蟲的生育能力。
圖2：R-loop在饑餓的AMPK突變體生殖細(xì)胞中積累。
A. 饑餓后的AMPK突變體（P0代）的生殖表型并非由蛋白質(zhì)合成時(shí)機(jī)不當(dāng)引起。上圖：野生型（WT）和aak-1/2幼蟲在含有CHX（濃度如圖所示）的M9緩沖液中維持3天后，轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)充足的培養(yǎng)基中。圖中顯示的是成蟲的可育比例，樣本量n≥150。下圖：在饑餓期間用CHX處理的AMPK突變體后代（F1和F2代）中，繁殖力缺陷并未得到恢復(fù)。圖中顯示的是aak-1/2突變體及其后代（F1和F2代）中繁殖力降低的頻率，樣本量n≥50。
B. R-loop在AMPK突變體的生殖細(xì)胞中積累。代表性顯微照片顯示了饑餓的AMPK突變體和WT年輕成蟲生殖細(xì)胞中的R-loop。thoc-2突變體的生殖細(xì)胞作為R-loop檢測的陽性對照。WT和aak-1/2的L1幼蟲饑餓3天后轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)充足的條件下。生殖細(xì)胞經(jīng)固定后，用S9.6抗體（紅色，標(biāo)記R-loop）進(jìn)行免疫染色，并用DAPI（藍(lán)色）進(jìn)行復(fù)染。圖中框出的部分在下方以更高倍率顯示（N=3，n=100）。星號（*）表示遠(yuǎn)端尖細(xì)胞；比例尺：5μm。右側(cè)圖：通過免疫熒光定量分析顯示，饑餓的AMPK突變體生殖細(xì)胞中R-loop的總體豐度顯著增加；n=100。
C. R-loop在AMPK突變體的原始生殖細(xì)胞（PGC）中形成，并在表達(dá)RNH-1后得以緩解。WT和aak-1/2的L1幼蟲饑餓3天后，用S9.6抗體（綠色，標(biāo)記R-loop）進(jìn)行免疫染色，并用生殖細(xì)胞特異性標(biāo)記物HIM-3同源物（HTP）-3（紅色）進(jìn)行復(fù)染。類似地，表達(dá)生殖細(xì)胞特異性RNH-1轉(zhuǎn)基因（pie-1p::rnh-1）的饑餓突變體動(dòng)物的R-loop水平與對照組相似。每種基因型的PGC中R-loop水平被定量并以圖形顯示。白色箭頭表示PGC（注意饑餓的AMPK突變體有額外的PGC）。
D. R-loop在AMPK突變體中隨著后代延續(xù)逐漸減少。通過免疫熒光使用S9.6抗體（紅色，標(biāo)記R-loop）和DAPI（藍(lán)色）復(fù)染，檢測P0（n=83）、F2（n=100）和F5（n=81）成蟲生殖細(xì)胞核中的DNA-RNA雜合體。白色箭頭表示R-loop（S9.6）焦點(diǎn)。P0（n=83）、F2（n=100）和F5（n=81）通過S9.6抗體進(jìn)行免疫熒光分析。
B. 野生型（WT）與aak-1/2基因組的DRIP-seq output（peak分?jǐn)?shù)和數(shù)量）的整體比較。
C. DRIP-qPCR驗(yàn)證。 收集了經(jīng)過或未經(jīng)DRB處理的饑餓的aak-1/2突變體的F2后代（饑餓3天）進(jìn)行DRIP分析。選擇tig-3作為陰性對照；n=3，均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（S.E.M.）。以input基因組DNA為基準(zhǔn)進(jìn)行信號值歸一化并繪制。
D. 以所有R-loop peaks為中心的GC偏好Meta圖。
E. 通過HOMER分析AMPK突變體與WT DRIP-seq鑒定的四個(gè)富集的de novo motif。
F. 上：注釋和R-loop peaks定位分析，顯示peaks比對到啟動(dòng)子-TSS、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)（TTS）、外顯子、內(nèi)含子和其他區(qū)域。在aak-1/2突變體中，peaks主要累積在啟動(dòng)子-TSS區(qū)域。
G. 下：WT或饑餓aak-1/2突變體F2后代DRIP-seq信號分布餅圖，顯示基因內(nèi)與基因間區(qū)域分布。
H. 基因組瀏覽器快照顯示饑餓的AMPK突變體F2后代中R-loop信號與H3K4me3水平正相關(guān)的代表性樣本。
（3）RAD-51異常積累與DNA損傷：
AMPK缺失的線蟲生殖細(xì)胞中，RAD-51焦點(diǎn)顯著增加，且與R-loop共定位。這些異常的RAD-51焦點(diǎn)可能與R-loop引起的DNA損傷相關(guān)，導(dǎo)致生殖細(xì)胞的凋亡增加。在缺乏p53信號通路的線蟲中，生殖細(xì)胞凋亡減少，但胚胎致死率增加，表明DNA損傷未被修復(fù)。
圖4. 饑餓導(dǎo)致AMPK突變體中RAD-51異常聚集到與R-loop相關(guān)的位點(diǎn)。
A. AMPK突變體L1幼蟲對基因毒性應(yīng)激敏感，并在饑餓后變得超敏感。饑餓或進(jìn)食4小時(shí)的L1幼蟲被暴露于25 mM HU和0.01% MMS中，這些濃度低于之前確定的導(dǎo)致野生型（WT）動(dòng)物不育的閾值（48）。
B. 饑餓的AMPK突變體生殖細(xì)胞中RAD-51焦點(diǎn)異常增加。
C. RAD-51焦點(diǎn)的數(shù)量和出現(xiàn)時(shí)間在生殖細(xì)胞的六個(gè)區(qū)域中的定量分析：有絲分裂區(qū)、過渡區(qū)、早中期偶線期、中期偶線期、晚中期偶線期和雙線期，n>5。
D. 代表性顯微照片顯示3天饑餓的L1幼蟲原始生殖細(xì)胞（PGC）中的RAD-51焦點(diǎn)。
E. 免疫熒光顯微照片顯示饑餓的WT、aak-1/2突變體以及aak-1/2；pie-1p::rnh-1轉(zhuǎn)基因線蟲的年輕成蟲生殖細(xì)胞晚中期偶線期區(qū)域中的RAD-51焦點(diǎn)。
F. 饑餓的AMPK突變體F2后代生殖細(xì)胞中異常豐富的RAD-51信號與R-loop重疊。上圖：PLA信號以紅色斑點(diǎn)表示。星號（*）表示遠(yuǎn)端尖細(xì)胞。下圖：每條生殖腺中帶有PLA焦點(diǎn)的細(xì)胞核的百分比定量分析。顯示AMPK突變體生殖腺的單抗體對照；n=5。
G. 左圖：饑餓的WT與AMPK突變體生殖腺中增加的細(xì)胞死亡依賴于DNA損傷。通過計(jì)數(shù)生殖腺臂中異常細(xì)胞死亡（CED）-1::GFP陽性細(xì)胞來定量凋亡小體。箱線圖顯示組內(nèi)平均值、50%范圍和最小到最大值，n=25。右圖：去除cep-1信號通路會增加饑餓的WT與AMPK突變體生殖腺中的胚胎致死率。定量分析之前饑餓的指定基因型動(dòng)物F2后代中的胚胎致死率。樣本數(shù)量：WT，n=10；aak-1(tm1844) I，aak-2(ok524) X，n=10；aak-1(tm1844) I，aak-2(ok524)X；cep-1(gk138) I，n=20；cep-1(gk138) I，n=20。
（4）跨代遺傳的生殖缺陷：
AMPK缺失導(dǎo)致的異常H3K4me3和R-loop的形成不僅影響當(dāng)前代，還會傳遞到未經(jīng)歷饑餓的后代中，導(dǎo)致生殖缺陷逐漸加劇。這些表觀遺傳修飾和R-loop跨代傳遞可能通過生殖細(xì)胞中的“分子記憶”實(shí)現(xiàn)。
圖5. R-loop位點(diǎn)上的RAD-51隔離限制了其在減數(shù)分裂中的可用性，導(dǎo)致饑餓依賴性生殖缺陷。
A. pie-1p::rad-51的多拷貝陣列可以部分恢復(fù)AMPK突變體在饑餓后的生殖能力。轉(zhuǎn)基因L1幼蟲在20°C下于M9緩沖液中維持72小時(shí)，隨后恢復(fù)到營養(yǎng)充足條件下。在恢復(fù)后96小時(shí)評估生育百分比。
B. 模型展示了在急性饑餓期間發(fā)生的AMPK依賴性事件。AMPK限制了異常的H3K4me3沉積及其隨后導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄，這種轉(zhuǎn)錄增加了R-loop的形成和基因組不穩(wěn)定性。
易小結(jié)：
本研究揭示了AMPK在饑餓條件下通過調(diào)控H3K4me3沉積和R-loop形成來維持基因組穩(wěn)定性和生殖細(xì)胞完整性的機(jī)制。AMPK缺失導(dǎo)致的異常表觀遺傳修飾和R-loop積累不僅影響當(dāng)前代，還會跨代傳遞，導(dǎo)致生殖缺陷和基因組不穩(wěn)定性。這些發(fā)現(xiàn)為理解環(huán)境應(yīng)激與表觀遺傳修飾之間的關(guān)系提供了新的見解，并可能對人類生殖健康和癌癥研究產(chǎn)生重要影響。
本研究的重要意義
ChIP-seq和DRIP-seq在本研究中的作用
DRIP-seq（DNA-RNA免疫沉淀測序）和ChIP-seq（染色質(zhì)免疫沉淀測序）是兩種關(guān)鍵的高通通量測序技術(shù)，分別用于研究R-loop的形成和組蛋白修飾的分布， DRIP-seq和ChIP-seq在本研究中共同揭示了AMPK缺失如何通過H3K4me3的異常沉積導(dǎo)致R-loop的形成，進(jìn)而引發(fā)基因組不穩(wěn)定性。
DRIP-seq專注于R-loop的全基因組分布及其與轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)系，而ChIP-seq則專注于H3K4me3修飾的分布及其對轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。
兩種技術(shù)的結(jié)合為理解AMPK在維持基因組穩(wěn)定性中的作用提供了全面的視角，并揭示了表觀遺傳修飾異常如何導(dǎo)致跨代生殖缺陷和基因組不穩(wěn)定性。
參考文獻(xiàn)：
Sun B, Sherrin M, Roy R. Unscheduled epigenetic modifications cause genome instability and sterility through aberrant R-loops following starvation. Nucleic Acids Res. 2023 Jan 11;51(1):84-98. pii: 6887602. doi: 10.1093/nar/gkac1155.
近日，加拿大麥吉爾大學(xué)生物系Bing Sun、McLean Sherrin、Richard Roy揭示了AMPK缺失導(dǎo)致的異常表觀遺傳修飾（特別是組蛋白H3K4me3的異常沉積）如何通過形成異常的R-loop結(jié)構(gòu)（RNA-DNA雜合體）影響基因組穩(wěn)定性，并導(dǎo)致生殖缺陷。還探討了這些表觀遺傳修飾和R-loop的跨代遺傳性，以及它們對生殖細(xì)胞完整性和DNA損傷響應(yīng)的影響。相關(guān)研究成果以“Unscheduled epigenetic modifications cause genome instability and sterility through aberrant R-loops following starvation”為題發(fā)表于《Nucleic Acids Research》（NAR）期刊。
標(biāo)題：Unscheduled epigenetic modifications cause genome instability and sterility through aberrant R-loops following starvation（饑餓后，異常的的表觀遺傳修飾通過異常的R-loop結(jié)構(gòu)導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性和不育）
發(fā)表時(shí)間：2023-1-11
發(fā)表期刊：Nucleic Acids Research
影響因子：IF 16.6 / 1區(qū)
技術(shù)平臺：ChIP-seq、DRIP-seq
在饑餓期間，生物體會調(diào)整基因表達(dá)和代謝以適應(yīng)能量脅迫。作者先前研究表明，AMP激活蛋白激酶（AMPK）缺乏的秀麗隱桿線蟲在從急性饑餓中恢復(fù)后，其生殖細(xì)胞中組蛋白H3在第4位賴氨酸上三甲基化（H3K4me3）水平異常升高，并表現(xiàn)出跨代生殖缺陷。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這些H3K4me3修飾在啟動(dòng)子區(qū)域顯著增加，驅(qū)動(dòng)異常的轉(zhuǎn)錄延伸，導(dǎo)致饑餓的AMPK突變體中R-loop結(jié)構(gòu)積累。
作者通過DNA-RNA免疫沉淀高通量測序（DRIP-seq）分析發(fā)現(xiàn)基因組中有相當(dāng)一部分區(qū)域受R-loop形成影響，尤其在染色質(zhì)被H3K4me3修飾的基因啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域影響最為顯著。與H3K4me3類似，R-loop也具有可遺傳性，可能促進(jìn)了這些突變體在饑餓后典型的跨代生殖缺陷。此外，AMPK突變體的生殖細(xì)胞在R-loop形成位點(diǎn)顯示出顯著更多的RAD-51（一種RecA類重組酶）焦點(diǎn)，這可能會限制它們在減數(shù)分裂斷裂或誘導(dǎo)性DNA損傷位點(diǎn)的正常功能。
本研究揭示了AMPK在饑餓后維持基因組穩(wěn)定性中的重要作用。R-loop對DNA損傷敏感性和生殖干細(xì)胞完整性的下游影響，可能解釋了在許多人類疾�。òǜ鞣N癌癥）中發(fā)生的異常表觀遺傳修飾。
研究方法
實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?/strong>使用秀麗隱桿線蟲（C. elegans），特別是缺乏AMPK的突變體（aak-1/2）。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：將線蟲置于饑餓條件下（M9緩沖液中3天），然后恢復(fù)營養(yǎng)供應(yīng)，觀察其生殖和基因組變化。
技術(shù)手段：
ChIP-seq（染色質(zhì)免疫沉淀測序）：用于分析H3K4me3在基因組中的分布。
DRIP-seq（DNA-RNA免疫沉淀測序）：用于檢測R-loop的形成和分布。
免疫熒光：檢測R-loop和RAD-51（一種DNA修復(fù)蛋白）的定位。
藥物處理和基因過表達(dá)：通過抑制轉(zhuǎn)錄延伸或過表達(dá)RNH-1（RNA酶H同源物）來研究R-loop的形成機(jī)制。
基因表達(dá)分析：通過4sU標(biāo)記和qPCR驗(yàn)證R-loop的形成與轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)系。
關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)
（1）H3K4me3的異常沉積
在饑餓條件下，AMPK缺失的線蟲中，H3K4me3在基因啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）區(qū)域顯著增加，這種異常沉積可跨代遺傳。此外，這些異常的H3K4me3位點(diǎn)與RNA聚合酶II（Pol II）的轉(zhuǎn)錄延伸活性相關(guān)，表明它們可能激活了本應(yīng)沉默的基因。
圖1. 饑餓的AMPK突變體后代中，異常的H3K4me3沉積主要發(fā)生在TSS區(qū)域。
B. H3K4me3 ChIP-seq信號在rps-20、orc-5、tlf-1、mdt-18和rpb-10基因的啟動(dòng)子-TSS區(qū)域的基因組瀏覽器快照。綠條表示啟動(dòng)子-TSS區(qū)域的H3K4me3信號peaks。軌跡高度代表測序reads數(shù)。
C. 野生型（WT）與AMPK突變體在TSS處的H3K4me3信號的線性軌跡。
D. WT和aak-1/2動(dòng)物在TSS處的H3K4me3信號的k均值聚類熱圖。
E. H3K4me3 peaks的注釋和定位分析。 分析了比對到啟動(dòng)子-TSS、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)（TTS）、外顯子和其他區(qū)域的H3K4me3 peaks。在aak-1/2突變體中，peaks主要累積在啟動(dòng)子-TSS區(qū)域。
F. 饑餓的AMPK突變體中異常的H3K4me3位點(diǎn)參與轉(zhuǎn)錄。 在L1滯育后的野生型（N2）和AMPK突變體F2成蟲中進(jìn)行抗H3K4me3的ChIP實(shí)驗(yàn)。
G. 饑餓的AMPK突變體中活躍轉(zhuǎn)錄水平更高。 使用4sU標(biāo)記法評估饑餓的AMPK突變體L1幼蟲的F2代后代中的活躍轉(zhuǎn)錄，同時(shí)處理的野生型對照組也進(jìn)行了類似分析（左圖）。在10分鐘脈沖標(biāo)記后評估并定量了4sU的摻入率（右圖）。
（2）R-loop的形成與積累：
在饑餓條件下，AMPK缺失的線蟲生殖細(xì)胞中R-loop顯著增加，尤其是在啟動(dòng)子-TSS區(qū)域。R-loop的形成與H3K4me3的異常沉積相關(guān)，且這種R-loop增加可以傳遞到后代中。通過RNH-1過表達(dá)或抑制轉(zhuǎn)錄延伸，可以減少R-loop的形成，并部分恢復(fù)線蟲的生育能力。
圖2：R-loop在饑餓的AMPK突變體生殖細(xì)胞中積累。
B. R-loop在AMPK突變體的生殖細(xì)胞中積累。代表性顯微照片顯示了饑餓的AMPK突變體和WT年輕成蟲生殖細(xì)胞中的R-loop。thoc-2突變體的生殖細(xì)胞作為R-loop檢測的陽性對照。WT和aak-1/2的L1幼蟲饑餓3天后轉(zhuǎn)移至營養(yǎng)充足的條件下。生殖細(xì)胞經(jīng)固定后，用S9.6抗體（紅色，標(biāo)記R-loop）進(jìn)行免疫染色，并用DAPI（藍(lán)色）進(jìn)行復(fù)染。圖中框出的部分在下方以更高倍率顯示（N=3，n=100）。星號（*）表示遠(yuǎn)端尖細(xì)胞；比例尺：5μm。右側(cè)圖：通過免疫熒光定量分析顯示，饑餓的AMPK突變體生殖細(xì)胞中R-loop的總體豐度顯著增加；n=100。
C. R-loop在AMPK突變體的原始生殖細(xì)胞（PGC）中形成，并在表達(dá)RNH-1后得以緩解。WT和aak-1/2的L1幼蟲饑餓3天后，用S9.6抗體（綠色，標(biāo)記R-loop）進(jìn)行免疫染色，并用生殖細(xì)胞特異性標(biāo)記物HIM-3同源物（HTP）-3（紅色）進(jìn)行復(fù)染。類似地，表達(dá)生殖細(xì)胞特異性RNH-1轉(zhuǎn)基因（pie-1p::rnh-1）的饑餓突變體動(dòng)物的R-loop水平與對照組相似。每種基因型的PGC中R-loop水平被定量并以圖形顯示。白色箭頭表示PGC（注意饑餓的AMPK突變體有額外的PGC）。
D. R-loop在AMPK突變體中隨著后代延續(xù)逐漸減少。通過免疫熒光使用S9.6抗體（紅色，標(biāo)記R-loop）和DAPI（藍(lán)色）復(fù)染，檢測P0（n=83）、F2（n=100）和F5（n=81）成蟲生殖細(xì)胞核中的DNA-RNA雜合體。白色箭頭表示R-loop（S9.6）焦點(diǎn)。P0（n=83）、F2（n=100）和F5（n=81）通過S9.6抗體進(jìn)行免疫熒光分析。
圖3. R-loop形成與H3K4me3異位沉積相關(guān)。
A. 基因組瀏覽器快照顯示基因鄰近區(qū)域和RNH軌跡的DRIP-seq信號。 綠色條表示R-loop peaks calling。軌跡高度代表reads數(shù)。B. 野生型（WT）與aak-1/2基因組的DRIP-seq output（peak分?jǐn)?shù)和數(shù)量）的整體比較。
C. DRIP-qPCR驗(yàn)證。 收集了經(jīng)過或未經(jīng)DRB處理的饑餓的aak-1/2突變體的F2后代（饑餓3天）進(jìn)行DRIP分析。選擇tig-3作為陰性對照；n=3，均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（S.E.M.）。以input基因組DNA為基準(zhǔn)進(jìn)行信號值歸一化并繪制。
D. 以所有R-loop peaks為中心的GC偏好Meta圖。
E. 通過HOMER分析AMPK突變體與WT DRIP-seq鑒定的四個(gè)富集的de novo motif。
F. 上：注釋和R-loop peaks定位分析，顯示peaks比對到啟動(dòng)子-TSS、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)（TTS）、外顯子、內(nèi)含子和其他區(qū)域。在aak-1/2突變體中，peaks主要累積在啟動(dòng)子-TSS區(qū)域。
G. 下：WT或饑餓aak-1/2突變體F2后代DRIP-seq信號分布餅圖，顯示基因內(nèi)與基因間區(qū)域分布。
H. 基因組瀏覽器快照顯示饑餓的AMPK突變體F2后代中R-loop信號與H3K4me3水平正相關(guān)的代表性樣本。
（3）RAD-51異常積累與DNA損傷：
AMPK缺失的線蟲生殖細(xì)胞中，RAD-51焦點(diǎn)顯著增加，且與R-loop共定位。這些異常的RAD-51焦點(diǎn)可能與R-loop引起的DNA損傷相關(guān)，導(dǎo)致生殖細(xì)胞的凋亡增加。在缺乏p53信號通路的線蟲中，生殖細(xì)胞凋亡減少，但胚胎致死率增加，表明DNA損傷未被修復(fù)。
圖4. 饑餓導(dǎo)致AMPK突變體中RAD-51異常聚集到與R-loop相關(guān)的位點(diǎn)。
B. 饑餓的AMPK突變體生殖細(xì)胞中RAD-51焦點(diǎn)異常增加。
C. RAD-51焦點(diǎn)的數(shù)量和出現(xiàn)時(shí)間在生殖細(xì)胞的六個(gè)區(qū)域中的定量分析：有絲分裂區(qū)、過渡區(qū)、早中期偶線期、中期偶線期、晚中期偶線期和雙線期，n>5。
D. 代表性顯微照片顯示3天饑餓的L1幼蟲原始生殖細(xì)胞（PGC）中的RAD-51焦點(diǎn)。
E. 免疫熒光顯微照片顯示饑餓的WT、aak-1/2突變體以及aak-1/2；pie-1p::rnh-1轉(zhuǎn)基因線蟲的年輕成蟲生殖細(xì)胞晚中期偶線期區(qū)域中的RAD-51焦點(diǎn)。
F. 饑餓的AMPK突變體F2后代生殖細(xì)胞中異常豐富的RAD-51信號與R-loop重疊。上圖：PLA信號以紅色斑點(diǎn)表示。星號（*）表示遠(yuǎn)端尖細(xì)胞。下圖：每條生殖腺中帶有PLA焦點(diǎn)的細(xì)胞核的百分比定量分析。顯示AMPK突變體生殖腺的單抗體對照；n=5。
G. 左圖：饑餓的WT與AMPK突變體生殖腺中增加的細(xì)胞死亡依賴于DNA損傷。通過計(jì)數(shù)生殖腺臂中異常細(xì)胞死亡（CED）-1::GFP陽性細(xì)胞來定量凋亡小體。箱線圖顯示組內(nèi)平均值、50%范圍和最小到最大值，n=25。右圖：去除cep-1信號通路會增加饑餓的WT與AMPK突變體生殖腺中的胚胎致死率。定量分析之前饑餓的指定基因型動(dòng)物F2后代中的胚胎致死率。樣本數(shù)量：WT，n=10；aak-1(tm1844) I，aak-2(ok524) X，n=10；aak-1(tm1844) I，aak-2(ok524)X；cep-1(gk138) I，n=20；cep-1(gk138) I，n=20。
（4）跨代遺傳的生殖缺陷：
AMPK缺失導(dǎo)致的異常H3K4me3和R-loop的形成不僅影響當(dāng)前代，還會傳遞到未經(jīng)歷饑餓的后代中，導(dǎo)致生殖缺陷逐漸加劇。這些表觀遺傳修飾和R-loop跨代傳遞可能通過生殖細(xì)胞中的“分子記憶”實(shí)現(xiàn)。
A. pie-1p::rad-51的多拷貝陣列可以部分恢復(fù)AMPK突變體在饑餓后的生殖能力。轉(zhuǎn)基因L1幼蟲在20°C下于M9緩沖液中維持72小時(shí)，隨后恢復(fù)到營養(yǎng)充足條件下。在恢復(fù)后96小時(shí)評估生育百分比。
B. 模型展示了在急性饑餓期間發(fā)生的AMPK依賴性事件。AMPK限制了異常的H3K4me3沉積及其隨后導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄，這種轉(zhuǎn)錄增加了R-loop的形成和基因組不穩(wěn)定性。
易小結(jié)：
本研究揭示了AMPK在饑餓條件下通過調(diào)控H3K4me3沉積和R-loop形成來維持基因組穩(wěn)定性和生殖細(xì)胞完整性的機(jī)制。AMPK缺失導(dǎo)致的異常表觀遺傳修飾和R-loop積累不僅影響當(dāng)前代，還會跨代傳遞，導(dǎo)致生殖缺陷和基因組不穩(wěn)定性。這些發(fā)現(xiàn)為理解環(huán)境應(yīng)激與表觀遺傳修飾之間的關(guān)系提供了新的見解，并可能對人類生殖健康和癌癥研究產(chǎn)生重要影響。
本研究的重要意義
- 表觀遺傳修飾與基因組穩(wěn)定性：研究揭示了AMPK在維持基因組穩(wěn)定性中的重要作用，特別是在饑餓等應(yīng)激條件下。異常的H3K4me3沉積和R-loop的形成可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性，這在人類疾病（如癌癥）中也有類似機(jī)制。
- 跨代遺傳的表觀遺傳效應(yīng)：研究表明，饑餓引起的表觀遺傳修飾可以跨代傳遞，并導(dǎo)致生殖缺陷。這為理解環(huán)境因素對后代健康的影響提供了新的視角。
- DNA修復(fù)與生殖細(xì)胞完整性：RAD-51的異常積累和DNA損傷響應(yīng)的失調(diào)可能影響生殖細(xì)胞的正常發(fā)育和功能，從而導(dǎo)致生殖缺陷。
ChIP-seq和DRIP-seq在本研究中的作用
DRIP-seq（DNA-RNA免疫沉淀測序）和ChIP-seq（染色質(zhì)免疫沉淀測序）是兩種關(guān)鍵的高通通量測序技術(shù)，分別用于研究R-loop的形成和組蛋白修飾的分布， DRIP-seq和ChIP-seq在本研究中共同揭示了AMPK缺失如何通過H3K4me3的異常沉積導(dǎo)致R-loop的形成，進(jìn)而引發(fā)基因組不穩(wěn)定性。
DRIP-seq專注于R-loop的全基因組分布及其與轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)系，而ChIP-seq則專注于H3K4me3修飾的分布及其對轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響。
兩種技術(shù)的結(jié)合為理解AMPK在維持基因組穩(wěn)定性中的作用提供了全面的視角，并揭示了表觀遺傳修飾異常如何導(dǎo)致跨代生殖缺陷和基因組不穩(wěn)定性。
參考文獻(xiàn)：
Sun B, Sherrin M, Roy R. Unscheduled epigenetic modifications cause genome instability and sterility through aberrant R-loops following starvation. Nucleic Acids Res. 2023 Jan 11;51(1):84-98. pii: 6887602. doi: 10.1093/nar/gkac1155.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
- RNA甲基化修飾和R-loop的交叉調(diào)控：從分子機(jī)制到臨床意義綜述
- DRIP-seq揭示AMPK通過R-loop形成以維持基因組穩(wěn)定和生殖細(xì)胞完整
- 微量WGBS應(yīng)用：揭示卵巢早衰的人卵丘細(xì)胞DNA甲基化與表觀基因組圖譜
- mRNA m5C修飾的鑒定、效應(yīng)分子、分子機(jī)制及其生理病理功能深度綜述
- MeRIP-seq揭示METTL3特異性重編程m6A RNA甲基化修飾并促進(jìn)腫瘤進(jìn)展
- acRIP-seq在揭示哺乳動(dòng)物mRNA乙�；揎梐c4C形成的分子機(jī)制中的應(yīng)用
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