介紹
新的單細胞技術(shù)促進了健康組織和癌癥中異質(zhì)細胞群的分析。單細胞全基因組測序可以研究腫瘤和健康組織的克隆結(jié)構(gòu)和遺傳變異，并且可以通過單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)確定不同的細胞類型或細胞狀態(tài)的變化。然而，基因組數(shù)據(jù)本身依賴于先驗知識來理解任何表型效應(yīng)。相反，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以說是衡量細胞表型的一種敏感指標，但其本身并不能揭示這種變異的根本原因。

最近，來自瑞典卡羅林斯卡研究所的Martin Enge教授及其同事報告了直接核標記和 RNA測序（DNTR-seq，Zachariadis 等人2020）的發(fā)展，這是一種聯(lián)合測序來自同一單細胞基因組 DNA 和 mRNA 以確定基因型對表型直接影響的方法。雖然已經(jīng)發(fā)表了其他聯(lián)合單細胞 mRNA 和 DNA 測序的方法，但它們的規(guī)�；�成本高得令人望而卻步，需要專門的設(shè)備，或者存在技術(shù)偏差，限制了它們的采用。我們分享一個使用 DNTR-seq的低成本實驗方案，無需專用設(shè)備，生成覆蓋均勻且技術(shù)偏差低的 DNA 文庫，并實現(xiàn)與黃金標準、單模態(tài)方法同等質(zhì)量的 mRNA 文庫。通過將 MANTIS®液體處理器與其他液體處理儀器結(jié)合使用，我們能夠在一天內(nèi)對 1500 個細胞進行多路復(fù)用和制備 DNA 和 RNA 文庫。在本應(yīng)用筆記中，我們將展示如何使用 MANTIS 執(zhí)行 DNTR-seq 并概述該系統(tǒng)的一些優(yōu)勢。

實驗方案
DNTR-seq是一種基于微孔板的多組學(xué)方法，其精確步驟在protocols.io網(wǎng)站上進行了描述。分離感興趣的組織并使用FACS分選器進行細胞分離，其中單細胞被分選到 384 孔板中。輕輕裂解細胞膜并進行離心步驟。然后輕輕吸入胞質(zhì)溶膠，將其轉(zhuǎn)移到另一個微孔板中。這實現(xiàn)了細胞核和胞質(zhì)溶膠的物理分離。每個部分都可以未經(jīng)處理地存儲，這使得實驗設(shè)計具有靈活性。

mRNA 測序基于Smart-Seq2，其中包括許多可以在 MANTIS 上以快速準確的方式執(zhí)行的分配步驟。首先，將Oligo(dT)引物與mRNA退火，然后進行逆轉(zhuǎn)錄和 PCR 預(yù)擴增，然后進行 PCR 純化、標記、PCR 和測序。全基因組測序基于直接標記，使用過度活躍的 tn5 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。此時，我們進行蛋白酶消化以從核蛋白中釋放基因組 DNA。然后通過轉(zhuǎn)座消化基因組 DNA，轉(zhuǎn)座裝載 Illumina 測序兼容的寡核苷酸，這些寡核苷酸通過PCR擴增添加。這樣我們就不需要執(zhí)行任何有損清理程序，直接標記方法最大限度地減少了位置偏差，使該方法成為調(diào)用拷貝數(shù)變異 (CNV) 的理想方法。

基因組和轉(zhuǎn)錄組測序的實驗方案都包括非常適合MANTIS的分配步驟。我們將重點介紹三種使用 MANTIS 降低成本的方法，即節(jié)省時間、節(jié)省試劑和最大限度地減少塑料消耗。

使用MANTIS的時間效率
我們系統(tǒng)的分液體積范圍為1μL到20μL，因此事實證明，能夠在小容量芯片（0.1 或0.5 μL 試樣）和大容量芯片（1或5μL 試樣）之間自由選擇非常有用。使用MANTIS，我們能夠在不到 3 分鐘的時間內(nèi)將1μL液滴分配到384孔板的每個孔中，并在大約8分鐘內(nèi)移液20μL（圖 1）。

圖 1. 分液時間

因為可以在胞質(zhì)溶膠解凍或從細胞核分裂3分鐘后設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄，所以這不僅大大增加了實驗室中的多路復(fù)用能力，而且還減少了我們必須處理mRNA的時間。因此，最大限度地減少RNA降解的機會。使用裂解緩沖液制備微孔板也是如此，因為我們在裂解緩沖液中加入了ERCC RNA Spike-In (External RNA Controls Consortium) 。

使用MANTIS最大限度地減少試劑浪費
我們在 DNTR-seq 實驗方案中同時使用 FORMULATRIX® 的低容量和高容量芯片。當使用低容量芯片時，我們使用移液器吸頭為儲液器裝載試劑，而當我們使用高容量芯片時，我們通過基于管道的儲液器裝載試劑。在制備一塊微孔板時（圖2），我們實驗室的兩種典型分配體積--20μL（使用高容量芯片）和 1.5μL（使用低容量芯片）--的不可恢復(fù)死體積分別僅為 4% 和 5.5%（圖 2）。

圖2. 試劑使用

通常，我們一次處理四塊微孔板，由于我們不需要為每塊微孔板充注芯片，因此不可回收的死體積下降到所制備試劑總體積的1%以下。

使用MANTIS最大限度地減少塑料消耗
在沒有MANTIS的情況下處理 384 孔板需要大量的移液器吸頭。通過使用 MANTIS執(zhí)行分配步驟，當我們需要復(fù)制微孔板和條形碼時，除了胞質(zhì)溶膠和細胞核部分之間的分離之外，我們無需使用吸頭。實驗方案中的一些試劑，如標記混合物和SDS，由于它們的一致性，使其難以移液，因此，即使可以進行非接觸式分液，也需要我們在手動移液時經(jīng)常切換吸頭。換用MANTIS后，我們節(jié)省了10盒用于處理一塊DNA實驗板和一塊RNA實驗板（384個細胞）的吸頭。這為 384 個細胞的 DNTR-seq 檢測節(jié)省了 130 多歐元。 

通過使用MANTIS，我們生成了兩種模式的高質(zhì)量庫（圖 3）。

圖 3. 在 Agilent TapeStation 上運行的成功 DNA（頂部）和 RNA（底部）DNTR-seq 文庫的概況。

MANTIS能夠快速移液，無需使用吸頭，且材料浪費少，因此非常適用于DNTR-seq（一種高度可擴展、靈活、基于板的方法）等方案。