介紹
藥代動力學(xué) (PK) 和藥效學(xué) (PD) 研究在藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。這些研究通常需要從具有高靈敏度和廣泛分析范圍的大量樣品中表征藥物和生物標(biāo)志物的濃度。

AlphaLISA® 技術(shù)（PerkinElmer, Inc., Waltham, MA）是傳統(tǒng)固相 ELISA 檢測的均相免洗替代品，可用于血漿和血清樣品中的生物標(biāo)志物檢測。

在 AlphaLISA 檢測中，使用生物素化抗體和抗分析物偶聯(lián)的受體珠來捕獲目標(biāo)分析物。生物素化抗體與鏈霉親和素包被的供體珠結(jié)合。當(dāng)樣品中存在分析物時，供體珠和受體珠會聚在一起。激發(fā)后，供體珠內(nèi)的光敏劑將環(huán)境氧轉(zhuǎn)化為激發(fā)單線態(tài)。單線態(tài)氧擴散到200 nm 以在受體珠中產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，從而導(dǎo)致光發(fā)射。光量與樣品中存在的分析物的量成正比，并且可以通過對照標(biāo)準(zhǔn)曲線對測定進(jìn)行量化。

與傳統(tǒng) ELISA 相比，AlphaLISA 工作流程已被證明可提供更低的檢測限、更高的測定精度和更寬的動態(tài)范圍，同時在測量血漿樣品中胰島素的樣品時體積減少 5 倍。該技術(shù)已應(yīng)用于支持高通量生物分析的自動化過程，在 6 小時內(nèi)可處理超過 10,000 個數(shù)據(jù)點。

與基于電磁閥的分液儀器相比，TEMPEST® 微流體分液儀器將 AlphaLISA 試劑添加步驟自動化，從而使試劑死體積從 30-65 毫升減少 6 倍至 5-10 毫升，同時在自動化的工作流程中保持分析性能。

材料和方法
如前所述制備生物素化抗體和抗分析物偶聯(lián)的受體珠和測定緩沖液。

在 384 孔板 (Optiplates, PerkinElmer) 中進(jìn)行該測定。在該測定中，校準(zhǔn)品和樣品一式兩份。通過從 96 孔樣品板轉(zhuǎn)移到 384 孔酶聯(lián)板，將測試樣品 (2 μL) 和標(biāo)準(zhǔn)品添加到反應(yīng)孔中。

使用 TEMPEST 或 FlexDropTM (PerkinElmer) 自動分液器，將 15 μL的 預(yù)混合抗體偶聯(lián)受體珠和置于測定緩沖液中的生物素化抗體添加到反應(yīng)孔中。

將酶聯(lián)板蓋上蓋子并在室溫 (RT) 下培養(yǎng)60 分鐘。在培養(yǎng)結(jié)束時，使用 TEMPEST 或FlexDrop 分液器添加置于測定緩沖液 (30 μL) 中的鏈霉親和素供體珠。 

將酶聯(lián)板再次蓋上蓋子并在室溫下培養(yǎng)30分鐘。此后立即使用 EnVision® 讀板器 (PerkinElmer) 檢測酶聯(lián)板。


 

結(jié)果
通過AlphaLISA自動檢測系統(tǒng)處理736個樣品，連續(xù)兩天進(jìn)行兩次單獨的測定。第一天的使用兩臺FlexDrop裝置處理樣品，將抗體和珠子分配到酶聯(lián)板上。第2天使用TEMPEST來處理樣品和分配試劑，并對所得的濃度值進(jìn)行比較（圖3）。得到的R2值為0.9741，平均回收率為101%。

第二個實驗的目的是為了判斷使用TEMPEST分配試劑檢測方法的穩(wěn)定性。使用50 pM的樣品處理了20塊微孔板。微孔板測試后CVs小于5%，20塊微孔板雙重測定的平均CVs小于3%（圖4）。
 

討論
AlphaLISA免疫測定的同質(zhì)免洗特性有利于實施高通量的自動化工作流程；然而，在擴大流程以支持大規(guī)模PK/PD研究中的生物標(biāo)志物檢測需求時，必須考慮試劑的成本。

我們設(shè)計了一個集成的機器人工作站，在6小時內(nèi)處理多達(dá)25個384孔板。為了滿足所需的檢測靈活性，最初的系統(tǒng)設(shè)計使用了兩臺FlexDrop儀器來分配AlphaLISA試劑。雖然這個系統(tǒng)設(shè)計能夠提供所需的產(chǎn)量，但FlexDrop分配器在充注步驟中消耗了多達(dá)50毫升的試劑，導(dǎo)致每塊微孔板的試劑成本大幅增加。

TEMPEST儀器采用的微流控隔膜泵技術(shù)使AlphaLISA試劑的充注量減少了3-5倍（圖5），同時保持了PK/PD研究所需的檢測性能和重復(fù)性。

此外，TEMPEST能夠從96個噴嘴中分配多達(dá)12種試劑，這使得一臺TEMPEST儀器可以取代兩臺FlexDrop儀器，降低了系統(tǒng)硬件的復(fù)雜性。最后，TEMPEST增加了容量，可以選擇運行多達(dá)8種不同的測定，而其他分配儀器只能運行6種測定。