具有致病性線粒體DNA (mtDNA)點(diǎn)突變的患者通常會(huì)出現(xiàn)致殘性神經(jīng)系統(tǒng)綜合征，導(dǎo)致嚴(yán)重殘疾和過(guò)早死亡[1]。至少有1/5000的人口受到mtDNA疾病的影響[2]。線粒體遺傳疾病的單核苷酸多態(tài)性(SNP)通常存在異質(zhì)性[3]，即：野生型和突變型共存。突變異質(zhì)率不同的個(gè)體表現(xiàn)出不一樣的臨床癥狀[1]。同質(zhì)的mtDNA突變可以很容易地在血液中檢測(cè)到。然而，對(duì)于異質(zhì)突變，突變mtDNA的百分比水平因組織而異，并且在同一個(gè)體中也可能隨時(shí)間而變化(例如，導(dǎo)致Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)的m.11778A>G)。因此SNP異質(zhì)率的精確檢測(cè)對(duì)線粒體遺傳疾病的診斷至關(guān)重要。最近，基于CRISPR的分子診斷技術(shù)因其特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注[4, 5]。例如，巢式RPA和CRISPR/Cas12a輔助病毒鑒定的多重分析平臺(tái)(MAPnavi)被用于快速(< 40分鐘)診斷多種呼吸道病毒[6]。然而，這些單信號(hào)輸出方法難以準(zhǔn)確診斷mtDNA疾病的異質(zhì)性水平，因?yàn)榻Y(jié)果受到樣本中模板總量的影響。與基因組SNP基因分型不同，mtDNA疾病的異質(zhì)性水平診斷需要更準(zhǔn)確的SNP豐度定量，這仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。

化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院劉翼振副教授團(tuán)隊(duì)在生物傳感器頂級(jí)期刊《Biosensors and Bioelectronics》上發(fā)表了題為“RatioCRISPR: A Ratiometric Biochip Based on CRISPR/Cas12a for Automated and Multiplexed Detection of Heteroplasmic SNPs in Mitochondrial DNA”的研究，2022級(jí)化學(xué)專業(yè)碩士研究生吳小龍為第一作者，陳勇副研究員和劉翼振副教授為共同通訊作者，深圳大學(xué)為唯一通訊單位。
Link:https://doi.org/10.1016/j.bios.2023.115676

該研究提出了一種自動(dòng)化的CRISPR/Cas12a比例型生物芯片傳感器(RatioCRISPR)，用于準(zhǔn)確量化線粒體疾病SNP的異質(zhì)性水平：首先，從mtDNA疾病患者的血液樣本中提取DNA。然后與RPA擴(kuò)增試劑混合，從樣品孔中加入到芯片。之后，芯片將按照預(yù)設(shè)程序自動(dòng)運(yùn)行(圖1a)。而后，采用比率信號(hào)輸出的方法，提高了穩(wěn)定性，最大限度地減少了樣品濃度對(duì)異質(zhì)性水平檢測(cè)的影響，使診斷結(jié)果只與模板中野生型和突變型的相對(duì)含量有關(guān)。最終RatioCRISPR實(shí)現(xiàn)了在25分鐘內(nèi)同時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)8個(gè)樣品，檢出限(LOD)為15.7 aM。并成功檢測(cè)了3種mtDNA點(diǎn)突變(m.3460G>A、m.11778G>A和m.14484T>C)的13個(gè)模擬樣本，這些突變導(dǎo)致Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)[8]，并設(shè)定了異質(zhì)性閾值(60%)來(lái)評(píng)估疾病風(fēng)險(xiǎn)。這種自動(dòng)化、精確的生物傳感器在診斷多個(gè)SNP，特別是具有異質(zhì)性的SNP具有廣泛的應(yīng)用，為遺傳咨詢、流行病學(xué)研究和多種異質(zhì)SNP疾病提供了一個(gè)快速、經(jīng)濟(jì)、實(shí)時(shí)的臨床診斷平臺(tái)。
  作者提出了一種通用的、自動(dòng)化的RPA-CRISPR/Cas12a比率測(cè)定芯片(RatioCRISPR)，用于mtDNA疾病的診斷。作者首次嘗試在基于CRISPR/Cas的生物芯片中引入比值信號(hào)輸出方法，實(shí)現(xiàn)SNP相對(duì)豐度的精確定量。該平臺(tái)具有以下優(yōu)點(diǎn):1）建立比率型信號(hào)輸出系統(tǒng)來(lái)量化異質(zhì)性水平，使樣品濃度的影響減小。2）集成式封閉芯片設(shè)計(jì)，避免氣溶膠污染，實(shí)現(xiàn)多路自動(dòng)化檢測(cè)。這種先進(jìn)、便捷的生物傳感器具有通用性、自動(dòng)化程度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，在診斷多個(gè)SNP，特別是具有異質(zhì)性變異的SNP方面具有良好的實(shí)用性和市場(chǎng)應(yīng)用前景。

RPA試劑盒及試紙條系列：

貨號(hào)	產(chǎn)品	規(guī)格
JY0209	雙靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型）	50T
JY0201	單靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型）	50T
JY0307	Tiosbio® CRISPR單酶切及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)試紙條	50T
JY0301	CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條	50T
JY0308	Tiosbio® CRISPR雙酶切檢測(cè)試紙條（變色龍）	50T
WLB8201KIT	DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（基礎(chǔ)型）	48T
WLE8202KIT	DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（熒光型）	48T
WLN8203KIT	DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（膠體金試紙條型）	48T
WLRB8204KIT	RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（基礎(chǔ)型）	48T
WLRE8205KIT	RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（熒光型）	48T
WLRN8206KIT	RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（膠體金試紙條型）	48T
WLB5001	DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體基礎(chǔ)型）	100T
WLN5002	DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體膠體金型）	100T
WLR5003	DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體熒光型）	100T
WLRB5001	RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體基礎(chǔ)型）	100T
WLRN5002	RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體膠體金型）	100T
WLRE5003	RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（液體熒光型）	100T

Cas酶系列

貨號(hào)	包裝規(guī)格	中文名稱
32108-01	100 pmoL	LbCas12a (Cpf1)
32108-03	1,000 pmoL	LbCas12a (Cpf1)
32117-01	100 pmoL	LwaCas13a (C2c2)
32117-03	1,000 pmoL	LwaCas13a (C2c2)
32118-01	100 pmoL	AapCas12b (C2c1)
32118-03	1,000 pmoL	AapCas12b (C2c1)
32119-01	100 pmoL	Un1Cas12f1 (Cas14a1)
32119-03	1,000 pmoL	Un1Cas12f1 (Cas14a1)
32104-01	100 pmoL	AsCas12a (Cpf1)
32104-03	1,000 pmoL	AsCas12a (Cpf1)
32116-01	100 pmoL	AacCas12b (C2c1)
32116-03	1,000 pmoL	AacCas12b (C2c1)
32106-01	100 pmoL	FnCas12a (Cpf1)
32106-03	1,000 pmoL	FnCas12a (Cpf1)
32110-01	100 pmoL	Lb5Cas12a (Cpf1)
32110-03	1,000 pmoL	Lb5Cas12a (Cpf1)
32101-01	100 pmoL	SpCas9
32101-03	1,000 pmoL	SpCas9
32102-01	100 pmoL	Sp-dCas9
32102-03	1,000 pmoL	Sp-dCas9
32120-01	100 pmoL	Sp-nCas9（H840A）
32120-03	1,000 pmoL	Sp-nCas9（H840A）