隨著測序項(xiàng)目的不斷擴(kuò)展和測序技術(shù)的持續(xù)發(fā)展，為了節(jié)省寶貴的時(shí)間和減少人力資源的消耗,實(shí)驗(yàn)室對(duì)于簡化文庫制備流程的需求日益迫切。
 
現(xiàn)今，自動(dòng)化文庫制備流程已經(jīng)成為應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)的有效策略。文庫制備的化學(xué)方法，例如支持自動(dòng)化、縮短工作流程以及減少移液步驟等特點(diǎn)也大幅提升了文庫制備過程的效率。
 
在本文中，我們將詳細(xì)介紹如何通過 Opentrons Flex平臺(tái)，結(jié)合 QIAseq® FX DNA Library Kit 與 QIAseq® Normalizer Kit 實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化文庫制備，從而更高效地為大腸桿菌、人類基因組以及混合微生物 DNA 制備文庫。
 
重點(diǎn)與概述
使用 Opentrons Flex 移液工作站，結(jié)合 QIAseq® FX DNA Library Kit 和 QIAseq® Normalizer Kit 進(jìn)行自動(dòng)化操作，能夠高效地完成 96 個(gè)樣本的文庫制備流程，整個(gè)過程僅需 4 - 5 小時(shí)，所需手動(dòng)操作時(shí)間不到 1 小時(shí)。
該工作流程結(jié)束后，我們得到了濃度為 4nM 的、高度均一、標(biāo)準(zhǔn)化的高通量全基因組測序（WGS）文庫。
為了應(yīng)對(duì)日益增長的測序需求，越來越多實(shí)驗(yàn)室正逐步引入自動(dòng)化技術(shù)。然而，對(duì)于許多實(shí)驗(yàn)室而言，自動(dòng)化是一項(xiàng)重大投資，并且還需要考慮與使用的化學(xué)試劑的兼容性、處理樣品的通量、整體工作流程的優(yōu)化以及需要手動(dòng)操作的時(shí)間等因素。
 
在本研究中，我們采用了一套自動(dòng)化的文庫制備流程，成功地制備了大腸桿菌 （E.coli） 、人類基因組以及混合微生物的 DNA 文庫，并在 Opentrons Flex 自動(dòng)化移液工作站上實(shí)現(xiàn)了文庫的標(biāo)準(zhǔn)化處理，單次處理樣本量高達(dá) 96 個(gè)。
 
QIAseq® FX DNA Library Kit 通過酶促片段化法和 UDI （雙唯一標(biāo)簽法）簡化了 NGS 文庫制備步驟。使用 QIAseq® FX DNA Library Kit 將文庫標(biāo)準(zhǔn)化至 4nM，無需 qPCR 定量，進(jìn)一步簡化工作流程。
 
Opentrons Flex 自動(dòng)化移液平臺(tái)配備了 Flex 移液器和相應(yīng)的耗材，以及多種模塊，如熱循環(huán)模塊、溫度模塊、熱振蕩模塊和環(huán)形磁力架，多元模塊協(xié)作運(yùn)行，使得樣本處理的通量高達(dá) 96 個(gè)。
 
材料與方法 樣本
三種全基因組測序文庫：(1)大腸桿菌(2)混合微生物群落和(3)人類(更多詳細(xì)信息請(qǐng)參閱表 1)。
 
文庫制備和標(biāo)準(zhǔn)化
在 Opentrons Flex 上使用 QIAseq® FX DNA Library Kit 工作流程制備全基因組文庫(參閱表 1、表 2)。使用 QIAseq® Library Normalizer Kit 工作流程 A 和 B 進(jìn)行文庫標(biāo)準(zhǔn)化。
 
質(zhì)控
測序之前，在 Agilent Tapestation High Sensitivity D1000 Screentape 上測定文庫的片段大小和濃度，并使用 KAPA Library Quantification kit 進(jìn)行 qPCR 定量。然后將樣品變性、稀釋，準(zhǔn)備上機(jī)測序。
 
測序
標(biāo)準(zhǔn)化的混合文庫在 Illumina MiSeq® (2 x 150 bp) 和 NextSeq® ( 2 x 75 bp ) 上進(jìn)行測序。
 
數(shù)據(jù)分析
測序數(shù)據(jù)去重后，將其上傳至 Galaxy 平臺(tái)。在 Galaxy 中 使 用 fastp 對(duì)雙端數(shù)據(jù)進(jìn)行分析 ，然后使用 BWA-mem 進(jìn)行基因組比對(duì)。最后，使用 Samtools 分析比對(duì)后的數(shù)據(jù)。
 
應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果
  圖 1 . QIA seq 工作流程初始甲板布局：兩個(gè) Flex 8 通道移液器、 Flex 轉(zhuǎn)板抓手和放置在甲板上的模塊。
  圖 2 . 在 Opentrons Flex 上自動(dòng)化 QIAseq® FX DNA Library Kit 和 QIAseq® Normalizer Kit 工作流程，可以將總體工作流程時(shí)間縮短數(shù)小時(shí)，并將實(shí)際操作時(shí)間縮短至不到 1 小時(shí)。時(shí)間是基于 96 個(gè)樣本通量的預(yù)估值。

Opentrons Flex NGS 工作站的應(yīng)用，使得 QIAseq® FX DNA Library Kit 和 QIAseq® Normalizer Kit 的自動(dòng)化操作成為可能。實(shí)驗(yàn)室可以根據(jù)自身樣本處理量的需求，選擇兩種不同的移液器配置：一種是兩個(gè) Flex 8 通道移液器的配置，適合處理多達(dá) 48 個(gè)樣本；另一種是單個(gè) Flex 96 通道移液器的配置，能夠應(yīng)對(duì)多達(dá) 96 個(gè)樣本的處理需求。
 
在處理 96 個(gè)樣本的情況下，手動(dòng)操作和自動(dòng)化流程所需時(shí)間的對(duì)比結(jié)果顯示：自動(dòng)化流程大幅度減少了全流程所需時(shí)間和手動(dòng)操作的勞動(dòng)強(qiáng)度。
  圖 3 . 以大腸桿菌基因組 DNA 制備的高產(chǎn)量和高均一性的文庫。圖中所顯示的數(shù)據(jù)是使用 8 個(gè)大腸桿菌 DNA 樣本各 100 ng 輸入量，經(jīng)過 15 分鐘的片段化和 6 個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增后， 生成的文庫數(shù)據(jù)。
  圖 4 . 在混合微生物樣本中，不同 GC 含量的物種之間的群落特征比較。所顯示的數(shù)據(jù)是從 8 個(gè) ATCCMSA-1003 樣品，使用 1 ng 輸入量，經(jīng)過 14 分鐘的片段化(含 2.5 μL FX Enhancer)、12 個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增和 1:10 的接頭稀釋而生成的。
  表 5 . 從人類基因組 DNA 制備的高產(chǎn)量和均一的文庫。該組數(shù)據(jù)是使用 Promega 公司提供的 8 各男性人類基因組 DNA 樣本生成的，輸入量為 100 ng ，經(jīng)過 15 分鐘的片段化和 6 個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。
為了驗(yàn)證自動(dòng)化工作流程的效能，我們制備了多種類型的全基因組測序文庫，涵蓋了大腸桿菌、人類基因組以及混合微生物樣本。
 
在這一過程中，我們注意到大腸桿菌的全基因組測序文庫展現(xiàn)出了較高的產(chǎn)量以及優(yōu)異的均勻性（圖3）�；旌衔⑸�物樣本所制備的 DNA 文庫表現(xiàn)出了豐富的產(chǎn)出以及良好的均衡性，其群落特征與預(yù)期的、具有不同 GC 含量的物種的群落特征相吻合（圖4）。同樣，對(duì)于人類基因組 DNA的文庫制備，我們也獲得了較高的產(chǎn)量和良好的均勻性（表5）。 圖 5 . QIAseq® Normalizer Kit 可以從不同輸入 DNA 濃度的樣本中產(chǎn)生重復(fù)性好、標(biāo)準(zhǔn)化的 DNA 文庫。為了證明這一點(diǎn)，我們使用 24個(gè)大腸桿菌 DNA 樣本，輸入量范圍從 10 到 100 ng （變異系數(shù)為 64.67% ）。我們使用 QIAseq® FX DNA Library Kit 和 QIAseq® Normalizer Kit（ 工作流程 B ） 處理了這些樣本，并在文庫制備后分別取出了標(biāo)準(zhǔn)化前和標(biāo)準(zhǔn)化后的等分樣本進(jìn)行檢測分析。分析可知，QIAseq® Normalizer Kit 制備的文庫濃度適合測序（平均為 1.8 ng/μl ），且文庫濃度的質(zhì)量不穩(wěn)定性下降（變異系數(shù)從 33.85% 降低到 13.53% ）。
QIAseq® Library Normalizer Kit 替代普通耗時(shí)的文庫定量方法，簡化了文庫制備過程，所得文庫均一性好（圖 5 ）。
 
應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)論
在本應(yīng)用指南中，我們展示了一種自動(dòng)化、超高效、簡單易用的全基因組測序（WGS）文庫制備和標(biāo)準(zhǔn)化工作流程。與手工相比，通過將自動(dòng)化與 QIAseq® FX DNA Library Kit 和 QIAseq® Normalizer Kit 相結(jié)合，工作流程的總體和實(shí)際操作時(shí)間大大縮短。與此同時(shí)，該工作流程可以制備得到產(chǎn)量高、質(zhì)量好的文庫。
 
作者
Matthew Akana, MS,1
Frances Slater, PhD,1
Shu Boles, PhD,2
Kinnari Watson, PhD,11Opentrons Labworks, Inc., 2QIAGEN, LLC