GelNest™基質(zhì)膠的使用方法及常見問題解析
GelNest™基質(zhì)膠是由小鼠腫瘤組織中提取的基底膜成分制備而成，包含的主要成分有層粘連蛋白、IV型膠原蛋白硫酸肝素糖蛋白等。這些成分可以提供細胞黏附、分化和增殖所需的支持和信號，同時也可以模擬生理環(huán)境中基底膜的特性，提高細胞培養(yǎng)的成功率和效果。
除了基底膜成分，GelNest™基質(zhì)膠中還富含多種生長因子。這些生長因子可以促進細胞分化、增殖和遷移，從而進一步模擬生理環(huán)境中的細胞信號通路和互動。GelNest™基質(zhì)膠具有廣泛的應用前景，特別是在組織工程、細胞培養(yǎng)和研究等方面，可被用于類器官培養(yǎng)、干細胞分化、血管生成、遷移或侵襲和體內(nèi)腫瘤發(fā)生等研究。
1.GelNest™高濃度基質(zhì)膠用于哪些實驗？
GelNest™高濃度基質(zhì)膠可適用于體內(nèi)應用研究，如高濃度蛋白可促進腫瘤生長。高蛋白濃度同時可使GelNest™基質(zhì)膠注射入小鼠皮下后保持完整，有利于注射的腫瘤細胞和/或血管生成因子的原位保持，便于用于原位分析和/或以后的切除。
2.GelNest™基質(zhì)膠包裝瓶的材質(zhì)是什么？
GelNest™基質(zhì)膠選用AccureVial®COP 瓶進行包裝運輸。環(huán)烯烴聚合物（COP）瓶作為中硼硅玻璃的替代品，具有極高的設(shè)計靈活性，其不易破碎的特點，也降低了物流運輸成本。
COP瓶優(yōu)勢：
★可耐受-196℃低溫儲存；
★較玻璃材質(zhì)而言不易破碎；
★低蛋白吸附性；
★可耐受PH值>10的溶液，不易產(chǎn)生脫片，對基質(zhì)膠進行安全性保護。
3.如何將GelNest™基質(zhì)膠用于3D培養(yǎng)？怎樣制作3D膠？需要將細胞嵌入到GelNest™基質(zhì)膠中嗎？
GelNest™高濃度基質(zhì)膠可適用于體內(nèi)應用研究，如制備厚層包被用于3D細胞培養(yǎng)。細胞可以嵌在GelNest™基質(zhì)膠中或者接種在GelNest™基質(zhì)膠表面（覆蓋法）。
4.使用GelNest™基質(zhì)膠時，移液器吸頭和離心管需要預冷嗎？
是的。因為GelNest™基質(zhì)膠在高于10℃的條件下即會開始成膠，我們推薦操作基質(zhì)膠時使用預冷的移液管、吸頭和離心管。
5.GelNest™基質(zhì)膠會快速聚合嗎？
GelNest™基質(zhì)膠在10℃至35℃時會快速聚合成膠。
6.什么情況下，需要使用無酚紅GelNest™基質(zhì)膠？
對于涉及顏色檢測的實驗，推薦使用無酚紅GelNest™基質(zhì)膠，如使用熒光染料或Drabkins法計數(shù)內(nèi)皮細胞成管實驗。對于子宮內(nèi)膜細胞培養(yǎng)，也需使用無酚紅GelNest™基質(zhì)膠。
此外，酚紅和非甾體雌激素結(jié)構(gòu)類似，有類雌激素效應。在實驗動物體內(nèi)可能具有干擾內(nèi)分泌和荷爾蒙代謝的能力。
7.如何從GelNest™基質(zhì)膠中收獲細胞？
推薦使用中性蛋白酶或細胞回收解決方案來收獲培養(yǎng)在GelNest™基質(zhì)膠中的細胞。中性蛋白酶相比胰酶、膠原酶或其他蛋白水解酶能夠更溫和有效地獲得單細胞懸液，不會損傷細胞或細胞表面蛋白。對于需要繼續(xù)接種培養(yǎng)或進行檢測的細胞，使用中性蛋白酶不會產(chǎn)生損傷。此外中性蛋白酶也可以用于組織分離。
對于代謝研究和RNA抽提，建議在4℃使用細胞回收解決方案進行非酶反應的細胞收集。因為GelNest™基質(zhì)膠中含有痕量的RNA，進行RNA分析時，應設(shè)一個GelNest™基質(zhì)膠（不接種細胞）的對照組。
其它從GelNest™基質(zhì)膠中收獲細胞的方法：降低溫度至4℃-6℃使GelNest™基質(zhì)膠解聚，需要一定的時間并且僅適合一部分應用。
8.GelNest™基質(zhì)膠包被過的培養(yǎng)皿可以儲存多長時間呢？
需要保存的情況下，可在37°C培養(yǎng)箱中最多存放7天。保存時GelNest™基質(zhì)膠表面需要使用無血清培養(yǎng)基均勻覆蓋，保持濕潤。
9.哪些情況下應該選用薄膠？什么時候用厚膠呢？3D培養(yǎng)有哪些應用？
薄膠主要用于輔助細胞貼壁，有利于細胞增殖。如原代細胞培養(yǎng)，需要一層薄薄的蛋白層輔助，就可以選用薄膠。
厚膠主要用于3D細胞培養(yǎng)，如大鼠主動脈組織分化為毛細血管樣結(jié)構(gòu)（RingAssay），以及進行細胞侵襲實驗等。3D細胞培養(yǎng)實驗，主要是用于研究細胞與細胞間的相互作用以及復雜結(jié)構(gòu)，如生物組織等。
10.進行內(nèi)皮管形成實驗，應該選用多大濃度的GelNest™基質(zhì)膠呢？
11.GelNest™基質(zhì)膠的最低成膠濃度是多少？
不同的實驗目的需要不同的GelNest™基質(zhì)膠濃度，用戶應該根據(jù)具體的實驗需求確定。
GelNest™基質(zhì)膠最低成膠濃度為7mg/mL。稀釋時不要簡單進行體積倍比稀釋，不同批次間的GelNest™基質(zhì)膠濃度有差異，應該根據(jù)最終工作濃度(mg/mL)算出需要加入的稀釋液體（如PBS或無血清培養(yǎng)基）的量。
用于體內(nèi)研究的GelNest™基質(zhì)膠，為了避免成膠不完全，最終工作濃度不應低于10mg/mL。
12.GelNest™基質(zhì)膠膠塊在體內(nèi)可以維持多長時間？
基質(zhì)膠膠塊可以在體內(nèi)維持至少一周的時間。
13.怎樣稀釋GelNest™基質(zhì)膠?
使用冰上預冷的無血清培養(yǎng)基或者PH=7.4的PBS。
14.應該如何對GelNest™基質(zhì)膠移液操作?
推薦使用預冷的移液器或者注射器操作，移液管、槍頭同樣需要預冷。吸液時不要觸及瓶子底部；分液時切忌過快、用力過猛。
如果使用移液管（Pipets），需要分液5mL時，應該吸取6mL，分液到移液管內(nèi)仍有1mL時即停止；如果使用自動移液器（Pipetman），按壓到第二檔位吸液，然后按壓到第一檔位進行分液。
15.為什么我的GelNest™基質(zhì)膠很粘稠？
基質(zhì)膠的蛋白濃度越高，膠體越粘稠。如果濃度高于13.0mg/mL，基質(zhì)膠會顯得非常厚重。
GelNest™基質(zhì)膠產(chǎn)品在未稀釋前都會比較粘稠。粘稠的高濃度GelNest™基質(zhì)膠不稀釋也可以直接使用，如用于培養(yǎng)腫瘤細胞和/或血管生成因子，注射于小鼠體內(nèi)后，細胞可以保持原位，便于原位分析和/或以后的切除；或者稀釋后，按照標準濃度的GelNest™基質(zhì)膠產(chǎn)品使用方法使用，具體稀釋濃度根據(jù)實驗需求確定。
除因為產(chǎn)品本身濃度高而粘稠外，基質(zhì)膠的狀態(tài)還與運輸過程中溫度的變化和儲藏條件有關(guān)。整個運輸過程中必須使用干冰冷藏。如果儲藏GelNest™基質(zhì)膠的冰箱帶有自動除霜功能，冰箱除霜過程中升溫，可能使基質(zhì)膠成膠。所以，切忌將GelNest™基質(zhì)膠儲藏于此類冰箱中。
為保證GelNest™基質(zhì)膠的使用效果，凍融次數(shù)應該盡可能減少。拿到新的GelNest™基質(zhì)膠后，請按照單次用量進行分裝。每次融化操作，GelNest™基質(zhì)膠都應該放置于冰上。
16.為什么GelNest™基質(zhì)膠在37°C成膠，而在4°C時卻呈液體狀態(tài)？
GelNest™基質(zhì)膠是一種從小鼠腫瘤中提取的重組基底膜，新鮮提取的原料中主要包括以下成分：層粘連蛋白，IV型膠原,巢蛋白，基底膜聚糖、表皮生長因子、類胰島素生長因子及其他生長因子。
這些蛋白構(gòu)成了GelNest™基質(zhì)膠的基本結(jié)構(gòu)。在22℃-37℃溫度條件下，大分子間的共價鍵可以結(jié)合，促使GelNest™基質(zhì)膠形成凝膠。而在低溫條件（如4℃）下，由于沒有足夠的能量促使共價鍵結(jié)合，所以GelNest™基質(zhì)膠呈現(xiàn)液體狀態(tài)。
17.GelNest™基質(zhì)膠可以反復凍融嗎？
建議用戶第一次融化后按照單次用量進行分裝，保存。
18.為什么細胞沒有貼壁？GelNest™基質(zhì)膠也脫落了？
首先需要檢查細胞的接種濃度是否過高，GelNest™基質(zhì)膠的用量應等同于細胞培養(yǎng)體系中培養(yǎng)基的用量。如果GelNest™基質(zhì)膠被稀釋到過低的濃度，形成的膠體容易從組織培養(yǎng)器皿表面分離。
19.未稀釋的GelNest™基質(zhì)膠中出現(xiàn)的沉淀應該怎么樣處理？
4℃下低速離心，去除沉淀物。
20.未使用完的GelNest™基質(zhì)膠應該怎樣保存的？
與細胞培養(yǎng)基或緩沖液混合過但未使用完的GelNest™基質(zhì)膠，不建議保留再用。
21.GelNest™基質(zhì)膠可以儲存在-70℃嗎？
是的。GelNest™基質(zhì)膠可以儲存在-70℃。建議客戶將整瓶的GelNest™基質(zhì)膠進行分裝，儲存于聚丙烯或其他可以耐受超低溫條件材質(zhì)的小管中，方便保存和使用。
22.GelNest™基質(zhì)膠會有自發(fā)熒光嗎？
GelNest™基質(zhì)膠是一種蛋白混合物，所以GelNest™基質(zhì)膠可能引發(fā)熒光的組分為蛋白質(zhì)成分。如果需要使用熒光檢測細胞生長狀態(tài)，建議使用者建立對照實驗，在所需要的波長條件下進行對比，以便排除背景熒光。
23.使用GelNest™基質(zhì)膠培養(yǎng)的細胞，如果需要進行切片或者免疫組織化學及免疫熒光檢驗，該怎樣固定呢？如何避免解聚？
可以使用2%濃度的多聚甲醛進行固定。為避免固定后出現(xiàn)解聚的情況，可以加入1%濃度的戊二醛。戊二醛作為固定劑，常用于電鏡觀察。
如果用戶需要進行免疫熒光檢驗，加入戊二醛后，會出現(xiàn)明顯的背景熒光。為了解決這一問題，我們建議用戶在固定之后，使用NaBH4進行淬滅。NaBH4極易產(chǎn)生氣泡，進行該步驟時，必須在水平操作臺上小心操作，避免晃動，盡量減少氣泡的形成。另外，用戶也可以嘗試使用較低濃度的戊二醛進行固定，如0.1%到0.5%，濃度越低，背景熒光信號越少。
24.為什么GelNest™的顏色不一樣？
因為二氧化碳和碳酸氫鹽緩沖液及酚紅的反應，冷凍或剛?cè)诮獾腉elNest™都有可能呈現(xiàn)不同顏色，顏色從稻草黃到暗紅色不等。
酚紅在冷凍或者酸性環(huán)境下呈現(xiàn)明黃色，在接近生理pH值或0ºC以上呈現(xiàn)紅色。
GelNest™出現(xiàn)顏色上的區(qū)別是正常情況，不會影響產(chǎn)品質(zhì)量，并且在和5%的二氧化碳平衡后，會恢復到統(tǒng)一顏色。
