摘要:隨著新發(fā)、突發(fā)重大傳染病以及惡性腫瘤等疾病防控需求的增加，以經驗開發(fā)為主的傳統(tǒng)疫苗體系亟待更新。高分子納微球因其獨特的理化優(yōu)勢，成為生物醫(yī)藥遞送領域研究和關注的焦點。但是如何對納微球體系進行合理化設計和工程化整合是疫苗遞送系統(tǒng)開發(fā)中遇到的重要挑戰(zhàn)。本團隊20年來在高分子納微球制備和應用方面進行了系統(tǒng)性研究，并提出納微球為“底盤”(Chassis)和亞單位疫苗共組裝成先進疫苗的策略，發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)制了高分子納微球新功能，闡明了其在細胞/黏膜免疫中的重要作用機理。本專論結合國內外研究現(xiàn)狀，圍繞上述研究工作，介紹了工程化疫苗底盤按需設計的思路和參考機制，同時也探討了其在生物醫(yī)藥領域的發(fā)展前景。

基于高分子納微球發(fā)展新型給藥系統(tǒng)成為生物醫(yī)藥領域研究和關注的焦點[1~3]。目前已有數(shù)種藥物的長效緩釋/控釋納微球制劑上市，為全球患者帶來福音。一方面，使用納微顆粒封裝半衰期短的多肽/蛋白藥物(如Bydureon艾塞那肽)，經過微球緩慢降解釋放，可大幅度延長藥物體內作用時間. 另一方面，通過顆粒裝載抗癌藥物(如Doxil阿霉素)，可借助納米尺寸實現(xiàn)藥物在腫瘤靶部位的蓄積，減少毒副作用。 雖然納微球包封技術已經發(fā)展了近70年，但這一領域在疫苗遞送方面的研究相對滯后. 直至1979年才有研究者提出使用聚乙烯醇共聚物顆粒(~ 1 mm)延緩抗原釋放[4]，減少疫苗接種次數(shù). 經過30年發(fā)展，進入臨床實驗的納微球佐劑疫苗品種仍屈指可數(shù). 尤其是針對新發(fā)、突發(fā)重大傳染病以及惡性腫瘤等疾病，僅具備緩釋性能或者納微米尺寸，將無法滿足相應疫苗的防控需求，亟須對納微球體系進行合理化設計和工程化整合，獲得高效的免疫應答水平。

理論上，球型顆粒同自然界中的病原性細菌、真菌、病毒等尺寸或維度相近[5]，更容易被機體識別為外源性物質，具有激發(fā)機體免疫應答等多重潛力. 但由于人工制備的生物可降解高分子納微球難以像生物顆粒那樣實現(xiàn)對其尺寸和功能的精準控制，納微球引發(fā)的免疫學效應及相關機制仍不清晰，相應疫苗的設計和開發(fā)受到阻礙. 為突破當前疫苗研發(fā)的壁壘，我們基于均一高分子納微球制備和應用方面的工作基礎，提出構建智能納微球材料，將其作為工程化疫苗“底盤”(Chassis)的策略(圖1). 通過對底盤的智能性設計和新功能創(chuàng)制，模擬病原體尺寸和性質，將亞單位疫苗抗原組裝在底盤上，制備出先進工程疫苗(復合病毒樣顆粒). 底盤可發(fā)揮病原體骨架和成分的雙重作用，不僅能提高疫苗的穩(wěn)定性，而且可以提升體液/細胞雙重免疫應答，滿足新型疫苗應答等需求，全面而深入地揭示免疫應答增強的關鍵因素和機理. 本專論將對本團隊基于均一納微球構建疫苗體系的相關研究進行總結，重點介紹工程化疫苗底盤按需設計的思路和參考機制。

Fig. 1 New strategy for advanced engineering vaccine by assemblingthe Chassis (micro/nanoparticles) and the components (antigens)

1.  納微球均一性的重要性

高分子納微球的粒徑、形貌、性能可用多種方法來實現(xiàn)調控，尤其是從單體(如苯乙烯)制備聚合物微球時，其物化性質的控制方法多種多樣[6]. 但是，對于能用于人體內的生物可降解或兼容性好的高分子材料(聚乳酸系列、殼聚糖系列)，主要以聚合物為起始原料制備微球，其制備以及粒徑和形貌控制是長期以來的難點.

傳統(tǒng)機械攪拌、均相乳化、超聲等制備方法制備高分子微球條件劇烈，如在制備底盤的同時負載疫苗，會造成疫苗失活；且已有生物可降解高分子功能較單一，無法像合成材料那樣在合成過程中賦予新的功能，必須采用新的策略賦予其智能性才能獲得有效的疫苗底盤和先進疫苗. 最重要的是，傳統(tǒng)制備方法由于剪切場不均一和Oswald熟化現(xiàn)象，無法形成均一液滴，造成顆粒均一性和穩(wěn)定性差.

利用不均一顆粒作為疫苗載體，不僅降低了實驗結果的可靠性，也影響了生物利用度和成藥性. 一方面，在進行免疫學效應研究時，抗原在體內分布不規(guī)律、釋放重復性差，實驗結果的波動性會被顯著放大，導致結果出現(xiàn)不一致甚至截然相反的現(xiàn)象[7,8]，難以系統(tǒng)地研究粒徑、形貌對免疫學效應的影響. 例如，Ying等利用噴霧干燥法制備出PLGA微米顆粒，吞噬率為61%，但由于微球尺寸不均一(粒徑大小從400 nm至4 μm不等)，從而影響了對該微球作為疫苗載體潛力的判斷. 另一方面，當進行到納微球制劑逐級放大階段時，制備和粒徑控制問題更加突出，如果均一性難以得到保障，勢必會引起批次間的顆粒性質出現(xiàn)差異，成藥性差. 雖然經過篩分可以得到粒徑均一的納微米顆粒，但是這一過程繁瑣復雜，耗時長，不僅浪費人力和財力，也會造成藥物和原料的浪費. 而且，對于多糖等黏度高的體系，即使篩分也難以獲得納米-至微米級的小粒徑顆粒.

2.  均一納微球制備新過程

粒徑均一微球制備是工程化疫苗底盤構建的基礎，需要克服多重挑戰(zhàn). 針對該難題，我們創(chuàng)建了預分散-快速膜乳化過程，可以實現(xiàn)納米到微米的粒徑均一可控，為底盤和先進疫苗的設計和應用奠定了基礎[9]. 該方法主要原理如下：在優(yōu)化的壓力下將傳統(tǒng)方法制備的高分子預乳液壓過具有一定長度和曲率的均一膜孔，借助彎曲膜孔的均勻剪切作用等克服界面張力，將預乳液分散成均一小液滴. 不同尺寸的均一納微顆粒可通過選擇特定孔徑的微孔膜，制得不同尺寸的均一乳液(油包水、水包油、水包油包水等)，再經物理或化學方法固化交聯(lián)后獲得. 在上述預分散-快速膜乳化法的發(fā)展過程中，我們發(fā)現(xiàn)預乳液粒徑、黏度、過膜壓力、膜彎曲度以及厚度是影響高分子納微球制備和粒徑控制的關鍵因素，建立應力-乳液體系-微孔膜的相關性理論，并進一步將該方法拓展至高黏度聚合物體系[10]，克服了傳統(tǒng)方法難以制備的瓶頸. 目前，使用膜乳化法已成功制備聚乳酸、殼聚糖、瓊脂糖、蒲甘聚糖和海藻酸鹽等十余種生物可降解高分子納微球和復合納微球，粒徑在100 nm至30 μm間均一可控，粒徑分布系數(shù)CV < 15，遠優(yōu)于傳統(tǒng)方法(CV值通常大于50%). 該過程能耗低且易放大，相關微球作為蛋白質分離介質以及多種規(guī)模的膜乳化設備均已商品化，為生物顆粒劑型的制備和進一步應用提供了簡便、高效和切實可行的手段(圖2).

Fig. 2 The process and instrumentsof membrane emulsification and its resultant particles (The fluorescentparticle panel was reprinted with permission from Ref.[20], Copyright (2008)WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim)

基于均一納微球的制備方法，后續(xù)相繼發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)制了生物可降解納微顆粒的多種新功能(如自發(fā)熒光[11]、pH敏感[12,13]、多級有序[14]等)和不同理化特性(包括尺寸[15~17]、形貌[18~22]和電荷[23~26]等). 顆粒的均一性保證了定量研究粒徑/物化等性質對免疫效果/機理影響的準確性，而顆粒的新功能為體內分布代謝的研究以及給藥和免疫療效的提升提供新的策略. 兩方面優(yōu)勢結合，不僅可以滿足生化分離介質[27,28]和蛋白藥物緩控釋[29~31]等多個方向的效用評價和機理研究，還為工程疫苗構建奠定了堅實基礎.

參考文獻

1. [1] McClements D J. Biotechnol Adv, 2018, 36: 1 − 12

2. [2] Huang P, Wang X, Liang X, Yang J, Zhang C, Kong D, Wang W. Acta Biomater, 2019, 85: 1 − 26 doi:10.1016/j.actbio.2018.12.028

3. [3] Ayer M, Klok H A. J Control Release, 2017, 259: 92 − 104 doi: 10.1016/j.jconrel.2017.01.048

4. [4] Preis I, Langer R S. J Immunol Methods, 1979, 28(1-2): 193 − 197 doi: 10.1016/0022-1759(79)90341-7

5. [5] Irvine D J, Swartz M A, Szeto G L. Nat Mater, 2013, 12(11): 978 − 990 doi: 10.1038/nmat3775

6. [6] Fenton O S, Olafson K N, Pillai P S, Mitchell M J, Langer R. Adv Mater, 2018, 30(29): e1705328

7. [7] Shah R R, O'Hagan D T, Amiji M M, Brito L A. Nanomedicine (Lond), 2014, 9(17): 2671 − 81 doi:10.2217/nnm.14.193

8. [8] Oyewumi M O, Kumar A, Cui Z R. Expert Rev Vaccines, 2010, 9(9): 1095 − 1107 doi: 10.1586/erv.10.89

9. [9] Ma G H. J Control Release, 2014, 193: 324 − 340 doi: 10.1016/j.jconrel.2014.09.003

10. [10] Zhou Q Z, Wang L Y, Ma G H, Su Z G. J Membr Sci, 2008, 322(1): 98 − 104 doi:10.1016/j.memsci.2008.05.025

11. [11] Wei W, Wang L Y, Yuan L, Wei Q, Yang X D, Su Z G, Ma G H. Adv Funct Mater, 2007, 17(16): 3153 − 3158 doi: 10.1002/adfm.200700274

12. [12] Wang L Y, Liu Q, Jia J L, Yang T Y, Ma G H. J Control Release, 2017, 259: e81 doi:10.1016/j.jconrel.2017.03.179

13. [13] Wu J, Wei W, Wang L Y, Su Z G, Ma G H. Colloid Surface B, 2008, 63(2): 164 − 175 doi:10.1016/j.colsurfb.2007.11.021

14. [14] Wei W, Ma G H, Hu G, Yu D, Mcleish T, Su Z G, Shen Z Y. J Am Chem Soc, 2008, 130(47): 15808 − 15810 doi: 10.1021/ja8039585

15. [15] Yue H, Wei W, Yue Z G, Lv P P, Wang L Y, Ma G H, Su Z G. Eur J Pharm Sci, 2010, 41(5): 650 − 657 doi:10.1016/j.ejps.2010.09.006

16. [16] Wei Q, Wei W, Lai B, Wang L Y, Wang Y X, Su Z G, Ma G H. Int J Pharmaceut, 2008, 359(1-2): 294 − 297 doi: 10.1016/j.ijpharm.2008.03.027

17. [17] Wang Y X, Qin J, Wei Y, Li C P, Ma G H. Powder Technol, 2013, 236: 107 − 113 doi:10.1016/j.powtec.2012.04.060

18. [18] Fan Q Z, Qi F, Miao C Y, Yue H, Gong F L, Wu J, Ma G H, Su Z G. Colloid Surface A, 2016, 500: 177 − 185 doi: 10.1016/j.colsurfa.2016.04.028

19. [19] Wei W, Ma G H, Wang L Y, Wu J, Su Z G. Acta Biomater, 2010, 6(1): 205 − 209 doi:10.1016/j.actbio.2009.06.005

20. [20] Wei W, Yuan L, Hu G, Wang L Y, Wu H, Hu X, Su Z G, Ma G H. Adv Mater, 2008, 20(12): 2292 − 2296 doi:10.1002/adma.200702663

21. [21] Wei Y, Wang Y X, Zhang H X, Zhou W Q, Ma G H. J Colloid Interf Sci, 2016, 478: 46 − 53 doi:10.1016/j.jcis.2016.05.045

22. [22] Xia Y, Na X, Wu J, Ma G. Adv Mater, 2018, 31: 1801159 doi: 10.1002/adma.201801159

23. [23] Liu Y Y, Chen X M, Wang L Y, Yang T Y, Yuan Q P, Ma G H. Particuology, 2014, 17: 74 − 80 doi:10.1016/j.partic.2014.02.006

24. [24] Wei W, Zhu D, Wang Z H, Ni D Z, Yue H, Wang S, Tao Y, Ma G H. J Mater Chem B, 2016, 4(15): 2548 − 2552 doi: 10.1039/C5TB02568K

25. [25] Yue Z G, Wei W, Lv P P, Yue H, Wang L Y, Su Z G, Ma G H. Biomacromolecules, 2011, 12(7): 2440 − 2446 doi: 10.1021/bm101482r

26. [26] Zhang W F, Wang L Y, Liu Y, Chen X M, Liu Q, Jia J L, Ma G H. J Control Release, 2015, 213: e113

27. [27] Zhao L, Wei W, Huang Y D, Zhang R Y, Zhu K, Hao D X, Su Z G, Ma G H. J Immunol Methods, 2018, 460: 45 − 50 doi: 10.1016/j.jim.2018.06.008

28. [28] Zhou W Q, Li J, Wei W, Su Z G, Ma G H. Colloid Surface A, 2011, 384(1-3): 549 − 554 doi:10.1016/j.colsurfa.2011.05.018

29. [29] Li X, Wei Y, Lv P P, Wu Y B, Ogino K, Ma G H. Colloid Surface A, 2019, 562: 237 − 246 doi:10.1016/j.colsurfa.2018.11.014

30. [30] Wei Y, Wang Y X, Wang W, Ho S V, Qi F, Ma G H, Su Z G. Langmuir, 2012, 28(39): 13984 − 13992 doi:10.1021/la3017112

31. [31] Wei Y, Wang Y X, Wang W, Ho S V, Wei W, Ma G H. J Mater Chem, 2011, 21(34): 12691 − 12699 doi:10.1039/c1jm12643a

關于森輝

中科森輝微球技術（蘇州）有限公司于2014年4月設立，位于蘇州工業(yè)園區(qū)的蘇州納米城，是一家集研發(fā)、生產、銷售于一體的知識驅動型高科技公司，致力為生命科學、生物技術等領域提供國際領先的自主產品以及“一體化”解決方案。公司擁有一支卓越的研發(fā)團隊和一系列自主知識產權的核心技術。技術團隊來自中國科學院，核心靈魂是我國生物材料和生化分離領域的知名專家馬光輝研究員和蘇志國研究員，以及十多位具有博士學位的技術骨干。

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