保存
大多數(shù)多肽在-20℃很穩(wěn)定,特別是冷凍干燥并保存在干燥器中,在將它們暴露于空氣之前,冷凍干燥多肽可以放于室溫。這將是濕度影響減少,當(dāng)無法冷凍干燥時,最好的方法是以小的工作樣量存放。
對于含Cys, Met orTrP的多肽,脫氧緩沖劑對其溶解必不可少,因為這種多肽可易空氣氧化,在封瓶前,慢慢流過多肽的氮氣或氬氣也會降低氧化作用。含Gln或Asn的多肽也容易降解,所有這些肽與不含這些有問題解苷的那些肽相比,生命期有限。
溶解性
大多肽的道選溶劑是超純抽氣水。稀乙酸或氨水分別對于堿性或酸性多肽的溶解很重要。這些方法不溶的多肽,需要DMF、脲、guanidiniamchloride或acetonitnle來溶解,這些溶劑可能某些實驗有副作用。所以我們建議設(shè)計多肽時要加注意。
殘基Ala, Cys , Ile, Leu, Met, Phe和Val將全增加多肽的溶解難度。
保存操作
包裝 1mg或更少的多肽按凈重包裝,聲明的小瓶重不含相關(guān)抗離子和水。 例如,氨基酸分析決定的肽含量是80%,在1mg樣品中,那么瓶中毛重是1.25mg。
大量的多肽以毛重算。標(biāo)出的重量含相關(guān)抗離子和水,例如,25mg樣品中肽百分比為90%,那么,實際肽量為25mg×90%=22.5mg
不要把肽含量和純度搞混了。肽的純度可能是100%, 而肽含量相關(guān)帶電基團(tuán)(如Arg, Lys)的抗離子量和肽新水性決定。這是合成肽的本身特性。
凍干肽的保存
所有產(chǎn)品應(yīng)存于冰箱, 最好為-20℃。多數(shù)肽以此方法可以存放幾年不變。
肽溶液的保存
溶液肽遠(yuǎn)比凍干形式不穩(wěn)定,溶液應(yīng)為中性pH(pH5-7), -20℃保存的,為避免樣品的反復(fù)凍融,最好分成小樣存放。一份樣品融凍后未用完, 應(yīng)扔掉,細(xì)菌降解有時會成為溶液肽的麻煩, 為克服此,肽應(yīng)溶于無菌水, 或肽溶液用0.2μM濾膜過濾。
多肽的重建和操作
多數(shù)肽溶于無菌蒸溜水。初次溶解時,要注意使初始濃度比要求濃度大,如果多肽僅有限溶解性,這便允許加入其它溶解劑或緩沖鹽。
如果多肽在水中的溶解性有限,有幾種選擇可幫助溶解:
對堿性肽用稀乙酸(含Arg , Lys , His)
酸性肽用稀氨水(含Asp, Glu)
對極疏水的肽用10%有機(jī)修飾物(Acetonitnile , Methanol)
極不溶的肽用DM50或DMF
guanicline hydrochloride或脲的濃溶液也很有用, 與上述方法合用, 聲處理也是溶解多肽的有效手段。
多肽的包裝
目錄中所有多肽除特別說明外,純度為95~98%。包裝為小瓶凍干粉。除特別注明外,多肽凈重包裝, 例如,1mg瓶的β-amyloid1-40精確含1mg的多肽。多肽凈重由氨基酸分析得到的肽含量計算。例如,一個多肽樣品毛重5mg,氨基酸含量85%,多肽凈重為5mg×0.85=4.25mg。
請注意,多肽含量不是多肽純度,與抗離子象乙酸鹽和溶劑,特別是水結(jié)合量合成多肽的本身特性。多肽純度可能達(dá)100%,但合成品中多肽含量由氨基酸組成,硫水性,和多肽對溶劑和離子的暴露決定,特別是在純化過程中,無論多肽如何純,凍干粉多肽含量一般為70-85%。剩余15-30%由其它基本非肽成份構(gòu)成。
多肽應(yīng)用保存
多肽具廣泛的溶解性。多肽不溶的主要問題是形成二級結(jié)構(gòu)。除了最太肽外,這點都會發(fā)生,在有多重疏水殘基的肽中更顯著。鹽會促進(jìn)二級結(jié)構(gòu)形成。我們建議先在無菌蒸餾水或去離子中溶解多肽。如需要增加溶解率,可用聲處理。溶解仍有問題,加少量稀乙酸(10%)或氨水,會便于溶解。
要長期保存多肽, 最好冷凍干燥,冷干粉可在-20℃或更低存放幾年而很少或無降解。溶液中的多肽遠(yuǎn)不穩(wěn)定。多肽易受細(xì)菌降解,應(yīng)用無菌純化水溶解。
含有Met, Cgs或Try殘基的多肽溶液由于氧化,壽命有限。應(yīng)溶于無氧溶劑, 為防止重復(fù)凍融的破壞,建議溶解過量的肽的便實驗,其余多肽以固體形成保存。
固相多肽合成Fmoc方法
任何多肽鏈的關(guān)鍵連接為肽鍵,由一個氨基酸的氨基與另氨基酸的縮合形成。通常一個氨基酸由一個中心碳原子組成,它由四個基它基團(tuán)包圍: 氨基、羰基、基和側(cè)鏈。 側(cè)鏈,稱為R,區(qū)別不同氨基酸的結(jié)構(gòu)。某些側(cè)鏈含有干擾肽鍵形成的功能團(tuán)。因此側(cè)鏈功能團(tuán)的封閉很重要。
上圖顯示了Fmoc合成的一般流程,首先第一個Fmoc氨基酸通過一個酸性接頭接到不溶載體樹脂上,F(xiàn)moc去保護(hù)通過用堿處理樹脂來完成,一般是Poperidine。 用預(yù)先激活或原位激活連接第二個Fmoc氨基酸。要求總多肽合成后,通過TFA分離來除去樹脂和去保護(hù)。