小鼠破骨細胞分化方案升級版
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| 破骨細胞是高度分化的多核巨細胞，主要來源于單核/巨噬細胞造血干細胞系，是一種具有骨吸收功能，在骨代謝方面起著關鍵性作用的細胞，因而機體對于破骨細胞的調控非常嚴格，在破骨細胞分化成熟的過程中，RANK /RANKL/OPG系統(tǒng)起著分化調控樞紐的作用，是調節(jié)破骨細胞分化成熟的關鍵信號途徑。核因子κB 受體活化因子配體（Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand ，RANKL）被認為是促進破骨細胞最為分化成熟及其功能活性最重要的因子，M-CSF可誘導RANK在破骨細胞前體的細胞膜上表達，進而使表達RANK的破骨前體細胞和RANKL結合并產(chǎn)生效應，誘導破骨細胞分化。因此在體外誘導破骨細胞分化過程中RANKL和M-CSF兩種細胞因子缺一不可。 |
| 然而有不少科研工作者在誘導分化破骨細胞（尤其是小鼠破骨細胞）時會遇到誘導不穩(wěn)定，誘導效率低等問題，PeproTech技術部門通過實驗總結以及查閱文獻對誘導失敗原因進行了分析： ▼ 破骨細胞的誘導是通過破骨前體細胞融合形成多核巨細胞，因此細胞的密度對融合很關鍵，人的破骨細胞體外分化通常由單核細胞進行分化誘導，由于是分選的細胞，純度很高，在誘導分化過程中細胞不會增殖，因此細胞密度可控，誘導成功率高；而小鼠的破骨細胞體外誘導分化是選擇骨髓細胞來進行誘導，骨髓細胞里面雖然有很多破骨前體細胞，但是在誘導分化過程中其它雜細胞會影響細胞之間的融合，此外在前期擴增過程中，細胞生長速度的差異最終會引起細胞密度的不可控，最終也會影響細胞的融合，導致誘導分化的失敗。 |
| 為了給客戶解決這一問題，PeproTech技術部門通過實驗操作驗證總結了一個新的小鼠破骨細胞誘導誘導方案，供大家參考！ |
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1. 小鼠骨髓細胞的獲得 1.1 小鼠(6~8周)頸椎脫臼法處死，將處死的小鼠放于含有酒精的小燒杯中浸泡2 min，消毒滅菌，在超凈臺中手術取出所有的脛骨和股骨，并用剪刀和鑷子將骨周圍的肌肉組織盡量去除干凈； 1.2 將取好的骨頭轉移到裝有無菌PBS的培養(yǎng)皿中，涮洗一次后轉移至另一個裝有無菌PBS的培養(yǎng)皿； 1.3 用剪刀剪去骨的兩端，再用注射器抽取PBS，針頭分別插入兩端骨髓腔中，用注射器打入PBS，反復沖洗骨髓至培養(yǎng)皿中，直至骨完全變白； 1.4 收集骨髓懸液，用篩網(wǎng)過濾去除小碎片和肌肉組織； 1.5 將濾過液500 g/5 min離心，棄去上清； 1.6 將離心后的沉淀彈散，加入2 ml紅細胞裂解液(1X)（Cat#64010-00-100），室溫裂解5 min 注：推薦使用BioGems紅細胞裂解液，裂解溫和，對骨髓細胞損傷��！ 1.7 加入10 ml完全培養(yǎng)基(α-MEM培養(yǎng)基+10%FBS+雙抗)終止裂解，然后500 g/5 min離心，棄去上清； 1.8 將離心后的沉淀彈散，用完全培養(yǎng)基(α-MEM培養(yǎng)基+10%FBS+雙抗)重懸細胞，至此已獲得小鼠骨髓細胞。 2. 巨噬細胞誘導分化 2.1 將細胞重懸到1-2*106/ml，加入終濃度為30ng/ml的小鼠M-CSF，按10cm的細胞培養(yǎng)皿中加入10ml細胞懸液鋪板，隔天換液一次，誘導分化5天待細胞長到80-90%密度，鏡下細胞都貼壁生長。 2.2 棄去培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)基，加入PBS清洗細胞一次，加入一定量的胰酶在37℃進行消化，待細胞開始變松散后加入血清及時終止消化，輕柔吹打細胞，將細胞收集到15ml離心管內(nèi)，離心棄去上清。 3. 破骨細胞誘導分化 3.1. 用誘導分化培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基+30ng/ml Murine M-CSF+50ng/ml Murine RANKL）重懸細胞。 3.2. 請按下表鋪入細胞數(shù)及對應的體積： |
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3.3 培養(yǎng)分化3~5天，隔天換液，一般在培養(yǎng)分化的第三天可以看到細胞融合，多個核細胞形成，此后要及時觀察融合情況，因為融合后的破骨細胞體外生存時間較短，容易破裂，要挑選合適的時間終止分化，進行下游實驗。 注：細胞因子購買后請按照說明書指示溶解并稀釋保存，不可反復凍融，誘導分化培養(yǎng)基請根據(jù)每次的用量配制，用多少，配制多少。 |
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| 誘導結果： |
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